“你好，我的樣本是養(yǎng)的細(xì)胞,，我還能做多色組化嗎,？”
答案是可以！對(duì)于多重?zé)晒饷庖呓M化（mIHC）來說,，幾乎不挑剔樣本類型,，但需要攻克一個(gè)難題——多輪洗脫。傳統(tǒng)的組織樣本經(jīng)過前期處理固定包埋,，再加上防脫載玻片的助力,，在洗脫過程中，脫片概率相對(duì)小,，即使有小部分脫落,，但影響不至于很大；而細(xì)胞樣本,，有可能在一張片子上,，本身細(xì)胞數(shù)量就不多，如果還有脫落,，可能最后“顆粒無收”,。今天Absin分享的是細(xì)胞樣本做多色的方法，其中不能缺少的依舊是我們的“老演員”——抗體洗脫液（abs994）,。
一,、建議操作步驟：
1）樣本準(zhǔn)備：制備細(xì)胞樣本（細(xì)胞爬片、細(xì)胞涂片等）,，建議直接使用腔室載玻片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),，方便后續(xù)檢測(cè)。完成制備后,，用PBS簡單漂洗（2×2min）,；
2）細(xì)胞固定：用4%多聚甲醛常溫固定10-20min,，PBS洗滌3×5min；
3）淬滅內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3% H2O2,，室溫下孵育10-30min,，PBS洗滌3×5min；
4）細(xì)胞通透（胞膜指標(biāo)省略此步）：滴加含1-0.25% Triton X-100的PBS溶液,，室溫下處理10min,，PBS洗滌3×5min；
5）封閉：滴加封閉液（5%二抗同來源封閉血清或BSA）,，室溫孵育30min,；
6）一抗孵育：棄封閉液，滴加稀釋好的一抗工作液,，于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或37℃ 1-2h（濕盒中可加少量水,，防止抗體孵育過程干片），PBS漂洗3×5min,；
7）二抗孵育：滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP二抗覆蓋組織,，避光室溫孵育20-50min，PBS漂洗3×5min,；
8）染料孵育：滴加現(xiàn)配的1*TSA染料工作液（使用信號(hào)放大液按1:100稀釋）,，反應(yīng)1-10min，PBS漂洗3×5min,；
9）抗體洗脫：抗體洗脫液37℃預(yù)熱,，甩去PBS后，滴加洗脫液浸潤整個(gè)爬片,，洗脫時(shí)間可控制在15-30min（洗脫難度：結(jié)構(gòu)性膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白＞胞漿蛋白＞胞核蛋白）,，PBS漂洗3×5min；
10）重復(fù)進(jìn)行步驟[5→9],，直到完成所有指標(biāo)染色,；
11）滴加1*DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區(qū)域,，室溫孵育10min,，PBS漂洗3×5min；
12）滴加抗熒光淬滅封片劑,，用蓋玻片封片,，避免氣泡；
13）掃描成像,，數(shù)據(jù)分析,。
二、注意事項(xiàng)：
1）若某些抗體難以洗脫，建議降低一抗稀釋比例,，或?qū)⒃摪悬c(diǎn)排到最后一輪進(jìn)行染色,；
2）抗體洗脫液在使用時(shí)要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整孵育時(shí)間和洗脫溫度，若時(shí)間太長有可能損傷抗原靶點(diǎn)以及細(xì)胞核形態(tài),；
3）若既有膜指標(biāo)又有胞內(nèi)指標(biāo),，可先做膜指標(biāo)，再做胞內(nèi)指標(biāo),，在進(jìn)行胞內(nèi)指標(biāo)染色之前再進(jìn)行打孔,，若一開始就打孔，可能影響胞膜指標(biāo)的染色,；
4）由于細(xì)胞樣本可能存在的脫片問題,，可在開始多色實(shí)驗(yàn)之前先模擬多次抗體洗脫的過程，多次使用抗體洗脫液洗脫與PBS漂洗,，觀察細(xì)胞脫落情況,，若明場(chǎng)不便觀察，可染一下DAPI再觀察,；
5）上述操作步驟并不一定適合所有樣本和抗體,，需要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié),。
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨期 |
| abs50012 | 四色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（鼠兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
| abs50028 | 四色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
| abs50013 | 五色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（鼠兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
| abs50029 | 五色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
| abs50014 | 六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（鼠兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
| abs50030 | 六色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
| abs50037 | 七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒plus（鼠兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
| abs50038 | 七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒plus（兔二抗） | 20T | 現(xiàn)貨 |
| abs994 | 抗體洗脫液（mIHC專用） | 30ml | 現(xiàn)貨 |
好消息,！Absin文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)重磅升級(jí)！
Absin特色產(chǎn)品線：
WB相關(guān)：ECL發(fā)光液,、預(yù)染marker,、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒,、組化筆,；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑,；血清,、BSA、蛋白酶K,、CTB,、TTX、CEE,；凋亡試劑盒,；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒,；重組蛋白,；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體,；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...
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