日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

近幾年,，類器官研究十分火熱，在信號通路機制,，藥篩藥敏等研究中對類器官模型需求激增,，其中利用crispr-cas9基因編輯技術(shù)對類器官進行敲低或敲減來造模是個不錯的實驗方法，今天小愛帶大家來了解crispr-cas9基因編輯技術(shù)及慢病毒轉(zhuǎn)染方法,。

crispr基因編輯技術(shù)中有三個最為重要的組成部分：crRNA,、sgRNA和Cas9蛋白。crRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合物,，sgRNA指引（crRNA/cas9）復(fù)合物靶向目的DNA區(qū)域定向切割DNA,，從而達到基因編輯的目的。

圖1 crispr-cas9基因編輯技術(shù)示意圖

crispr-cas9基因編輯技術(shù)大體上有三種技術(shù)路線：All in one質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法,，病毒轉(zhuǎn)化法,，RNP復(fù)合物導(dǎo)入法。病毒轉(zhuǎn)化法是將sgRNA,、crRNA和表達cas9蛋白的序列整合進病毒中,，再使用病毒感染細胞。相較于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法,，優(yōu)點在于sgRNA,、crRNA和表達cas9蛋白可以持續(xù)存在于細胞中，從而達到一個很高的基因編輯效果,。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染細胞示意圖

很多小伙伴對類器官轉(zhuǎn)染方法十分好奇,，類器官慢病毒轉(zhuǎn)染和細胞轉(zhuǎn)染大同小異，主要有以下幾個問題需要注意：

1,、類器官在進行慢病毒轉(zhuǎn)染時需不需要從基質(zhì)膠里解離出來,？

考慮到病毒對于基質(zhì)膠的穿透性及轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染時建議將類器官從基質(zhì)膠中解離出來,，用適當(dāng)培養(yǎng)基重懸在孔板內(nèi)進行,。

2、類器官在進行慢病毒轉(zhuǎn)染時需不需要消化成單個細胞,？

類器官在進行慢病毒轉(zhuǎn)染時,，消化成單個細胞來轉(zhuǎn)染效率比較高，建議消化成單個細胞進行感染,。

3,、類器官轉(zhuǎn)染慢病毒多長時間合適,？

轉(zhuǎn)染時間可根據(jù)實際實驗情況調(diào)整,，通常是轉(zhuǎn)染12-36小時，可以借鑒細胞轉(zhuǎn)染時間。

4,、類器官篩選時要不要消化成單個細胞,？如果不需要消化，從膠里解離出來就行,？還是在基質(zhì)膠里就行,？

類器官篩選不需要消化成單個細胞，在基質(zhì)膠里就可以篩選,，大部分的藥物都可以穿透基質(zhì)膠,，作用到類器官上。

以下給大家整理了類器官轉(zhuǎn)染步驟：

1）收集類器官并消化成單個細胞后,，按2×10⁵/孔鋪到24孔板中（細胞密度可以自行摸索）,；
2）用含有6μg/ml polybrene（polybrene的濃度可以自行摸索）的1ml新鮮類器官培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液,，37℃孵育,；
3）（對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟）4小時后加入1ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene；
4）繼續(xù)培養(yǎng)12-36小時后,，如有少量細胞貼壁,，可用槍頭輕柔吹打下來，混勻,，將細胞培養(yǎng)基混懸液收集至離心管中（一般是6-8孔為一組）,。300g 4℃ 富集離心5min后移去上清，添加1ml左右類器官傳代培養(yǎng)緩沖液（abs9730）轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管,，重新重懸離心,；
5）觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠（abs9495）重懸混勻（金屬冰盒或冰上操作）,；
6）以24孔細胞培養(yǎng)板為例,，每孔點膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進行鋪板（金屬冰盒或冰上操作），將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠,，添加500-750μl 類器官培養(yǎng)基（恢復(fù)室溫）進行培養(yǎng),；
7）待類器官出現(xiàn)明顯增殖現(xiàn)象（一般需要2-3天），更換含有藥物的類器官培養(yǎng)基進行篩選（如嘌呤霉素等）,，沒有轉(zhuǎn)染成功的類器官將會裂解凋亡,，從而篩出成功轉(zhuǎn)染的類器官；

（* 圖源網(wǎng)絡(luò),，僅供學(xué)習(xí)參考用）

今天講解就到這了,，大家如有實驗問題，歡迎公眾號后臺交流哦,！

好消息,！Absin文獻獎勵重磅升級！

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液,、預(yù)染marker,、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒,、組化筆,；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑,；血清,、BSA、蛋白酶K,、CTB,、TTX、CEE,；凋亡試劑盒,；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒,；重組蛋白,；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體,、對照抗體,；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...