2023年2月8日,，俄亥俄州立大學(xué)董一州團(tuán)隊(duì)在Advanced Science發(fā)表了一篇LNP成功遞送saRNA至精母細(xì)胞治療小鼠不育的文章“Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice"。
基因突變引起的男性不育癥是不育癥的重要類型,。目前,，臨床上還沒有可靠的方法來解決這種醫(yī)療需求。
mRNA療法的出現(xiàn)為修復(fù)生殖系統(tǒng)中的突變基因提供了一種可能的策略,。然而,，將mRNA有效遞送至精母細(xì)胞仍然是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。因此,，研究團(tuán)隊(duì)希望開發(fā)一種新的LNP可以將saRNA有效遞送至精母細(xì)胞,，用于治療男性不育癥。
一,、CAP LNP的合成,、配方和表征
為了增強(qiáng)mRNA遞送進(jìn)入精子細(xì)胞，在生物膜和男性生殖系統(tǒng)起到關(guān)鍵作用的一些生物活性分子引起研究人員的關(guān)注,。例如,，膽固醇是哺乳動物細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分，維持細(xì)胞膜的完整性和通透性,。先前有研究報(bào)道在精子生成過程中膽固醇水平會升高,，這表明膽固醇代謝與生育能力之間存在密切關(guān)系。此外,，磷酸基團(tuán)是磷脂的極性部分,，同時(shí)也是是生物膜的關(guān)鍵組成部分，參與細(xì)胞運(yùn)輸途徑,。最后,，氨基可以電離變?yōu)檎娦缘模c帶負(fù)電的mRNA相互作用,。除了生物活性之外,，可電離的脂質(zhì)的幾何結(jié)構(gòu)，可以用包封參數(shù)（P值）來描述,，會極大地影響 LNPs的傳遞效率,。通常，P 值大的脂質(zhì)有利于形成倒錐形,，有利于內(nèi)體膜的倒六邊形（HII 相）轉(zhuǎn)變和遞送貨物的內(nèi)體逃逸,。
為了實(shí)現(xiàn) LNPs 將編碼功能蛋白的 mRNA 遞送進(jìn)精母細(xì)胞中，恢復(fù)精子生成的目標(biāo),，他們整合了3個(gè)生物活性分子單元,，設(shè)計(jì)一系列膽固醇-氨基-磷酸酯(CAP)脂質(zhì)，配制成CAP LNPs,。CAP LNP 由CAP,、DOPE,、DMG-PEG和編碼Dmc1的mRNA配制而成。在顯微注射到曲細(xì)精管后,，CAP LNP將Dmc1 mRNA遞送到精母細(xì)胞，從而恢復(fù)染色體重組和精子發(fā)生,。
圖1 使用CAP LNP遞送編碼Dmc1的 mRNA 的示意圖
首先,，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一條 CAP 衍生物的合成路線（圖 2a），并進(jìn)一步表征了它們的理化性質(zhì),，最終選擇了CAP2-4 LNPs進(jìn)行后續(xù)研究,。研究者應(yīng)用 CAP2-4 LNP 在Dmc1 -/-小鼠模型中遞送綠色熒光蛋白(GFP) mRNA，24小時(shí)后分析 GFP 的表達(dá),。如圖 2e所示,，CAP2-4 LNPs 在曲細(xì)精管周圍誘導(dǎo)出明顯的綠色熒光，而 MC3 LNPs 和 ALC-0315 LNPs 組中幾乎檢測不到 GFP 信號,。這些結(jié)果證明 CAP2-4 LNPs 是精母細(xì)胞中 mRNA 遞送的優(yōu)良載體,，遞送效率明顯高于 MC3 和 ALC-0315 LNPs。
圖2 CAP 脂質(zhì)的合成方法,、3D結(jié)構(gòu)以及在生精小管中的遞送效率比較
二,、CAP LNP可將saRNA遞送至Dmc1-/-小鼠模型中的精母細(xì)胞
接下來，作者比較了傳統(tǒng) mRNA和saRNA 之間 Dmc1 蛋白的表達(dá)時(shí)程,。他們將帶有 Flag 標(biāo)簽的 Dmc1 mRNA 或 saRNA 封裝到CAP2-4 LNP 中,，并將兩種制劑注射到 Dmc1-/-小鼠的曲細(xì)精管中。給藥后24和72小時(shí),，通過免疫熒光染色評估曲細(xì)精管中 Dmc1 的表達(dá),。如圖3a所示，在CAP2-4 LNP-mRNA和CAP2-4 LNP-saRNA 處理的小鼠中24小時(shí)均觀察到明顯的 Dmc1 表達(dá),，但在未處理的小鼠中則沒有,。CAP2-4 LNP-mRNA給藥72小時(shí)后，曲細(xì)精管中幾乎沒有熒光信號（圖3b）,。相反,，CAP2-4 LNP-saRNA處理組仍然顯示出強(qiáng)烈的熒光信號（圖3b）。這些結(jié)果表明,，通過 CAP2-4 LNP 遞送 saRNA 可以維持 Dmc1 蛋白表達(dá)至少三天,。
圖3 在 Dmc1-/-小鼠中遞送編碼 Dmc1蛋白的傳統(tǒng)mRNA或saRNA
三、使用CAP LNP遞送saRNA恢復(fù)Dmc1蛋白功能
隨后,，作者通過分析聯(lián)會復(fù)合體(SC)來檢查 Dmc1 蛋白的功能,。SC 是在減數(shù)分裂 I 期間形成的特定結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)同源染色體的聯(lián)會,。由于 Dmc1 缺陷可破壞 SC 形成并阻止減數(shù)分裂 I 后期的精子發(fā)生,，因此 SC 被認(rèn)為是 Dmc1 蛋白功能恢復(fù)的關(guān)鍵指標(biāo),。Dmc1-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理，處理后第4天,，收集睪丸,。通過 SYCP1 和 SYCP3（參與 SC 形成的兩個(gè)主要成分）的免疫熒光染色檢查精母細(xì)胞中的 SC。如圖4a所示, SYCP3和SYCP1染色清楚地顯示了 WT 小鼠的五個(gè)亞階段的特征模式,，包括細(xì)線期,、偶線期、粗線期,、雙線期,、終變期。在CAP2-4 LNP-saRNA 處理組中,，我們觀察到處于粗線期的SC,，這表明同源染色體聯(lián)會的恢復(fù)。此外,，對SC在雙線期和終變期的觀察進(jìn)一步證實(shí)了SC可以解體并轉(zhuǎn)運(yùn)到中期（圖4b）,。相反，來自 Dmc1-/-小鼠的 SC 在前期的早期階段被阻滯,，并且未觀察到粗線期,、雙線期和終變期的 SC（圖4c）。如圖4d所示,，在 CAP2-4 LNP-saRNA 處理后,，粗線期、雙線期和終變期精母細(xì)胞的百分比分別增加到 11%,、6% 和 2%,。總的來說,，這些結(jié)果表明使用 CAP LNP 遞送 saRNA 可恢復(fù)精母細(xì)胞中 Dmc1 蛋白的功能,。
圖4 使用CAP LNP遞送saRNA可恢復(fù)Dmc1-/-小鼠中的Dmc1功能
四、CAP LNP-saRNA 挽救 Dmc1-/-小鼠的精子發(fā)生
最后,，作者研究了通過 CAP2-4 LNP-saRNA 恢復(fù) Dmc1 蛋白是否可以挽救 Dmc1-/-小鼠的不育癥,。Dmc1-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理。處理后第10天,，收集睪丸和附睪,。睪丸和附睪切片用花生凝集素(PNA)染色，它可以特異性結(jié)合精子細(xì)胞頂體（圖5a）,。PNA 染色的精子細(xì)胞位于 WT 小鼠的曲細(xì)精管和附睪管中,。然而，Dmc1-/-小鼠的睪丸和附睪中沒有細(xì)胞被 PNA-凝集素染色,，表明精子細(xì)胞生產(chǎn)喪失,。相比之下,，我們在 CAP2-4 LNP-saRNA 治療組的曲細(xì)精管和附睪管中觀察到了 PNA染色的細(xì)胞，這是挽救 Dmc1-/- 小鼠不育表型的直接證據(jù),。統(tǒng)計(jì)分析顯示,，治療組每根小管的PNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于未治療組，達(dá)到WT組的二分之一左右（圖5b）,。因此,，這些結(jié)果證明，使用 CAP LNP 遞送 saRNA可以有效挽救 Dmc1-/-小鼠中的精子細(xì)胞產(chǎn)生,。
此外，對睪丸樣本進(jìn)行組織學(xué)分析以評估生精發(fā)育,。如圖5c所示,，WT 小鼠表現(xiàn)出正常的睪丸形態(tài)，而 Dmc1-/-小鼠在精母細(xì)胞階段表現(xiàn)出精子發(fā)生停滯并且缺乏減數(shù)分裂后細(xì)胞,。與 WT 小鼠相比,，Dmc1-/-小鼠的生發(fā)層厚度和生精管直徑顯著降低（圖5d，e）,。相比之下,，CAP2-4 LNP-saRNA 重建了 Dmc1-/-小鼠的睪丸形態(tài)，增加了生發(fā)層厚度和生精管直徑（圖5d,，e),。精子懸液細(xì)胞學(xué)涂片顯示，CAP2-4 LNP-saRNA處理組的附睪產(chǎn)生橢圓頭單尾不卷曲的精子,，而未處理組未觀察到精子樣細(xì)胞（圖5f）,。
圖5 使用 CAP LNP 遞送saRNA可挽救 Dmc1 -/-小鼠的不育表型
總的來說，這項(xiàng)研究利用 CAP LNPs 可以向精母細(xì)胞傳遞 mRNA,，證明基于mRNA療法在治療由基因突變引起的男性生殖疾病方面的可行性,。Absin擁有成熟的mRNA制備及LNP包裹技術(shù)。
線性mRNA定制流程：
 | 線性mRNA定制化合成/定制化服務(wù) 服務(wù)參數(shù)： 1,、合成量大于等于200ug/條 2,、加帽方式：化學(xué)共轉(zhuǎn)錄法 推薦帽結(jié)構(gòu)：CynCap AG 3、修飾堿基： N1-methyl-Pseudouridine-5'-Triphosphate 4,、標(biāo)準(zhǔn)定制UTR：Cyn-CBT 5,、序列設(shè)計(jì)：1條（定制化合成）；不少于3條（定制化服務(wù)） 6,、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控：RNA完整性檢測,，RNA純度膠圖 7、可選實(shí)驗(yàn)：LNP包裹（請?jiān)儍r(jià)） 8,、合成周期：2-4周（定制化合成,，不包括細(xì)胞驗(yàn)證） 4-8周（定制化服務(wù)） |
環(huán)狀RNA定制流程：
 | 環(huán)狀RNA定制化合成/定制化服務(wù) 服務(wù)參數(shù)： 1,、合成量大于等于200ug/條 4、標(biāo)準(zhǔn)交付：1.0 ug/ul 5,、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控：濃度,；純度 6、合成周期：4-8周（定制化合成）,；6-8周（定制化服務(wù)） |
標(biāo)準(zhǔn)臨床概念驗(yàn)證方案流程：
標(biāo)準(zhǔn)臨床概念驗(yàn)證方案是我司新推出的專項(xiàng)服務(wù),，可以同時(shí)匹配mRNA線性/環(huán)狀技術(shù)，協(xié)助快速推進(jìn)靶點(diǎn)的概念驗(yàn)證,，推進(jìn)不同構(gòu)型的mRNA技術(shù)在動物實(shí)驗(yàn)上獲得藥效學(xué)結(jié)果,，以期能夠快速進(jìn)入轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的級別。
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參考文獻(xiàn)
[1] Du S, Li W, Zhang Y, et al. Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice. Adv Sci (Weinh). 2023 Feb 7:e2300188.
Absin特色產(chǎn)品線：
WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker,、預(yù)制膠,；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆,；IP/CoIP試劑盒,；激動劑/抑制劑；血清,、BSA,、蛋白酶K、CTB,、TTX,、CEE；凋亡試劑盒,；呼吸爆發(fā)試劑盒,；ELISA試劑盒；重組蛋白,；抗體: 二抗,、標(biāo)簽抗體、對照抗體,；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...
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