細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術(shù),，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術(shù),。不論對于整個生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說,，細胞培養(yǎng)都是一個不可少的過程,，細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)模克隆,。
細胞培養(yǎng)的步驟
1,、復(fù) 蘇
細胞復(fù)蘇的原則：快速融化
必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃,，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶,，對細胞造成損害,。
實驗前準備
將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。
細胞實驗室進行常規(guī)消毒,，用75%酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面,，保證無菌。
在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管,、吸管,、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。
取出凍存管
根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應(yīng)編號,。
從液氮罐中取出細胞盒,，取出所需的細胞，同時核對管外的編號,。
迅速解凍
迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍,，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化,。
約1-2min后凍存管內(nèi)液體溶解,，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi),。
平衡離心
用架盤天平平衡后,，放入離心機中3000r/min 離心3分鐘。
制備細胞懸液
吸棄上清液,。
向離心管內(nèi)加入適量培養(yǎng)液,，吹打制成細胞懸液。
用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞,，細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度,，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細胞計數(shù)
細胞濃度以5×105/ml為宜,。
培養(yǎng)細胞
將符合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi),，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h(或者24-48h)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng),，換液的時間根據(jù)細胞情況而定,。
記錄復(fù)蘇日期
2、傳 代
01,、傳代密度過高
一旦細胞養(yǎng)太久至融合度過高(>90%)才傳代,，容易使細胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細胞時不易吹打成單顆細胞,，即便再重新鋪盤傳代,，細胞也無法回到原本的特性了。(如：單層細胞,，沒長滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象),。
解決方案
盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達到80%即可傳代分盤,。
細胞融合度：在細胞培養(yǎng)中指的是細胞在培養(yǎng)表面(培養(yǎng)皿/瓶)所占的比例,。
02、傳代密度過低
哺乳動物貼壁培養(yǎng)細胞,，若細胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開始傳代,，在傳代接種細胞密度過低，細胞間距離太遠,，就無法在細胞間產(chǎn)生黏附及通信作用,，幫助信號傳導(dǎo)并活化細胞；總體細胞量不足,，分泌的生長因子濃度會不足以產(chǎn)生利于生長的微環(huán)境,，以上皆會造成增殖速度遲緩或細胞死亡。
解決方案
細胞傳代時,，要進行準確的細胞計數(shù),，確保鋪盤的密度。
3,、凍 存
細胞凍存的基本原理：慢凍
手動降溫：將細胞依序放在4℃(30分鐘),、-20℃(1小時)、-80℃(過夜)后移至液氮中保存,。
程序降溫盒：是一般廣泛使用的降溫法,，為一種特制冷凍容器(填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱)，使細胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃(過夜),，然后移至液氮中保存,。
由此可以看出，程序降溫精準度更高,，優(yōu)于手動降溫,。
部分低溫保護劑在緩慢冷凍過程中雖然會保護細胞，但它們也會引起細胞毒性,，尤其是在室溫下,。因此，在標準的自制凍存液中,，會含有血清,，血清是用來降低細胞毒性的,，但血清也不是完整的,。
9
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務(wù)