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早在2000年和2011年,，Weinberg 和 Hanahan博士提出的腫瘤標(biāo)志性特征中，其中一個(gè)標(biāo)志性特征即為誘導(dǎo)血管新生,。腫瘤血管新生是腫瘤發(fā)生發(fā)展,、浸潤與轉(zhuǎn)移的重要條件。本文將從血管生成概念,、腫瘤血管生成的過程,、腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤血管生成的調(diào)控,、腫瘤血管生成的臨床藥物，以及血管生成的13個(gè)研究策略進(jìn)行闡述,。

血管生成（Angiogenesis）

血管生成（Angiogenesis）是指從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管,。新生血管的生長和成熟是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜和協(xié)調(diào)的過程，血管的形成與發(fā)展取決于血管生成促進(jìn)因子和抑制因子的動(dòng)態(tài)平衡（如圖1）,。

圖1.血管生成平衡

腫瘤血管生成的過程

腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖,，消耗大量的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)實(shí)體瘤的體積小于2mm3時(shí),，可以通過擴(kuò)散獲得氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),。隨著腫瘤組織的逐漸生長，腫瘤需要形成新的血管來獲取營養(yǎng)和氧氣,，以確保腫瘤呈指數(shù)增長（如圖2）,。

圖2.經(jīng)典的血管生成開關(guān)

腫瘤的血管生成起源于腫瘤中已存在的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后小靜脈。首先,，血管周細(xì)胞（綠色）脫落,，血管擴(kuò)張；接著內(nèi)皮細(xì)胞（紅色）遷移到血管周圍空間,，向腫瘤細(xì)胞或宿主細(xì)胞產(chǎn)生的血管生成刺激方向遷移,；然后內(nèi)皮細(xì)胞順著血管生成方向增殖，這一過程可能由周細(xì)胞引導(dǎo),；內(nèi)皮細(xì)胞相互粘附并形成一個(gè)管腔,，并伴隨著基底膜的形成和周細(xì)胞的附著。最后,，血管芽會(huì)與其他芽融合,，建立新的循環(huán)系統(tǒng)（如圖3）。

圖3.新血管形成過程

腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤血管生成的調(diào)控

缺氧

實(shí)體腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,，高耗氧量,、營養(yǎng)缺乏和細(xì)胞中代謝物質(zhì)的積累可能會(huì)產(chǎn)生不適合腫瘤細(xì)胞生長的缺氧微環(huán)境。在常氧條件下,，HIF-1α和HIF-2α被PDH和FIH-1羥基化,，并通過蛋白酶體介導(dǎo)的降解來降解。在腫瘤的缺氧環(huán)境中,，F(xiàn)IH-1和PHDs的失活不能羥基化HIF-1/HIF-2α,，降低HIFα-VHL結(jié)合，促進(jìn)HIFα-HIFβ二聚體進(jìn)入細(xì)胞核,，激活血管生成相關(guān)基因,，并促進(jìn)腫瘤中的血管生成擬態(tài)（如圖4）。

圖4.缺氧在腫瘤血管生成中的作用

血管生成因子

在腫瘤微環(huán)境中,，多種細(xì)胞可以分泌促腫瘤血管生成因子,，它們?cè)谡{(diào)節(jié)正常和異常血管生成中發(fā)揮重要作用,。其中VEGF在腫瘤血管生成中起關(guān)鍵作用。

VEGF通過與其受體(VEGF R1-3)結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤血管生成,，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路（如圖5）,。

?增殖

VEGFR可與Grab/Src/Gab1/Shb/PKCγ相互作用，激活RAF/MEK/MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路,，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,。

?遷移和侵襲

VEGFR可以通過與cdc42、Rho和Rac GTPases結(jié)合,，激活PI3K/AKT,，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲。

?通透性

VEGFR可以通過激活NFAT/β-catenin/VE-cadherin和eNOS來增強(qiáng)血管通透性,。

?血管生成擬態(tài)

VEGFR可以通過上調(diào)EMT相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)EMT誘導(dǎo)的血管生成擬態(tài),。

圖5.VEGF/VEGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

細(xì)胞因子

腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中分泌自分泌和旁分泌細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子在腫瘤的生長,、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用,。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞因子在腫瘤血管生成中起重要作用（如圖6）,。

圖6.細(xì)胞因子對(duì)腫瘤血管生成的調(diào)控

非編碼核糖核酸

腫瘤血管生成不僅受腫瘤微環(huán)境中血管生成因子和細(xì)胞因子的調(diào)控,，還通過非編碼RNA等多種細(xì)胞內(nèi)成分進(jìn)行調(diào)控。這些分子可以通過外體或非外體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入腫瘤細(xì)胞（如圖7）,。

圖7.非編碼RNA在調(diào)節(jié)腫瘤血管生成中的作用

腫瘤血管生成的臨床藥物

血管生成是腫瘤進(jìn)展的重要組成部分,，在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。20世紀(jì)70年代,，F(xiàn)olkman教授提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成,，抑制血管生成可作為腫瘤治療的一種治療策略。近年來,，靶向促血管生成基因已成為腫瘤治療和預(yù)防腫瘤擴(kuò)展的研究熱點(diǎn),。目前FDA批準(zhǔn)的抗血管生成藥物根據(jù)靶點(diǎn)的數(shù)量分為兩類:單靶點(diǎn)抑制劑和多靶點(diǎn)抑制劑。VEGF是抗腫瘤血管生成的重要靶分子（見表1）,。

表1

血管生成研究策略

(1)內(nèi)皮細(xì)胞遷移試驗(yàn)

內(nèi)皮細(xì)胞遷移是血管生成的標(biāo)志之一,，也是血管生成級(jí)聯(lián)反應(yīng)的早期步驟之一,。

傷口愈合試驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng),、傷口愈合試驗(yàn)是表征細(xì)胞遷移活性的基本讀數(shù)之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至融合,，用刀片/移液管端在孔的中間形成一個(gè)直的間隙,。洗滌并去除漂浮的細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后,，在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移圖像,。對(duì)細(xì)胞遷移的距離進(jìn)行可視化,，并通過image-Pro Plus分析軟件捕獲圖像（如圖8）。

圖8.采用傷口愈合法檢測(cè)HUVECs的遷移情況,。

(2)內(nèi)皮細(xì)胞增殖試驗(yàn)

在過去的幾十年里,，已經(jīng)發(fā)展出了許多不同的解決細(xì)胞增殖的方法。一般來說,，這些方法包括細(xì)胞數(shù)量的評(píng)估,、通過摻入標(biāo)記的核苷酸類似物來檢測(cè)DNA合成、DNA含量的測(cè)量,、增殖標(biāo)記物的檢測(cè)和代謝分析（如圖9）,。

?細(xì)胞計(jì)數(shù)：自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或血細(xì)胞計(jì)數(shù)器

?DNA標(biāo)記：3H-thymidine、BrdU,、edu,、PI、DAPI,、Fucci

?增殖標(biāo)志物：PH3,、PCNA、Ki67

?代謝分析：MTT測(cè)定

圖9.內(nèi)皮細(xì)胞增殖試驗(yàn),。a.在常規(guī)的96孔板上生長的HUVEC的相位對(duì)比度圖像（左）和二值化圖像,。b.MTT檢測(cè)的例子，顏色強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量相關(guān),。c. PI檢測(cè)HUVECDNA染色,，平板細(xì)胞儀測(cè)量。d. HUVEC用sunitinib處理后的細(xì)胞活力,，發(fā)光法測(cè)定,。

(3)血管形態(tài)發(fā)生的3D模型

通過血管發(fā)生或血管生成，血管網(wǎng)絡(luò)的出現(xiàn)需要細(xì)胞形成穩(wěn)定的3D管,，這一過程涉及這些細(xì)胞的分化,、遷移、增殖,、聚集和重排,，形成索，然后形成管腔,。綜上所述,，這個(gè)過程被稱為血管形態(tài)發(fā)生。隨后,，EC招募血管周圍的間質(zhì)細(xì)胞（周細(xì)胞）來穩(wěn)定這個(gè)新形成的網(wǎng)絡(luò),，并減少血液灌注時(shí)的滲漏。血管形態(tài)發(fā)生的三維分析如圖10所示。

?纖維蛋白珠測(cè)定

?膠原蛋白測(cè)定

?視網(wǎng)膜外植體測(cè)定

?血管化的微器官平臺(tái)（VMO）

圖10.血管形態(tài)發(fā)生的三維分析,。a. I型膠原蛋白和EC包覆的細(xì)胞珠嵌入在3D纖維蛋白凝膠基質(zhì)中,，以測(cè)量EC的發(fā)芽和管腔形成。b. 相差顯微鏡觀察EC發(fā)芽和管腔形成,。c. EC管的形成可以通過將EC嵌入I型膠原基質(zhì)中來測(cè)量,。d.一旦形成，這些管腔可以通過甲苯胺藍(lán)染色和亮視野顯微鏡觀察到,。e.將出生后小鼠的完整的解剖視網(wǎng)膜包埋在I型膠原-基質(zhì)膠混合基質(zhì)中,，并在促血管生成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以刺激EC發(fā)芽,。f.相差顯微鏡觀察小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)發(fā)生,。g.VMO平臺(tái)利用了“小動(dòng)脈"（高壓）和“小靜脈"（低壓）微流控通道，這些通道通過在介入的組織室內(nèi)通過血管生成形成的活微血管網(wǎng)絡(luò)連接,。h. 用70kDa的FITC-dextran（綠色）灌注,，可以測(cè)量形成的微血管系統(tǒng)(EC，紅色)的滲漏,。

(4)主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)

大鼠或小鼠主動(dòng)脈外植體在ECM凝膠中時(shí),，具有體外發(fā)芽和形成分支微血管的能力（圖11）。該系統(tǒng)中的血管生成是由主動(dòng)脈釋放的內(nèi)源性生長因子及其在解剖過程中響應(yīng)損傷時(shí)的生長所驅(qū)動(dòng)的,。主動(dòng)脈壁的這種特性在20世紀(jì)80年代早期被描述,，并導(dǎo)致了主動(dòng)脈環(huán)檢測(cè)的發(fā)展，現(xiàn)在被廣泛用于研究血管生成的基本機(jī)制和測(cè)試促血管生成或抗血管生成化合物的療效,。

圖11.主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn),。a.第6天拍攝的大鼠主動(dòng)脈無血清膠原凝膠培養(yǎng)（星號(hào)）（箭頭標(biāo)記的微血管）。b.用VEGF(5ng/ml)處理的主動(dòng)脈培養(yǎng)顯示微血管數(shù)量增加（第6天）,。c.主動(dòng)脈來源的微血管(E),、未閉腔(L)和周圍周細(xì)胞(P)的電鏡圖；內(nèi)皮緊密連接用箭頭表示,。d.由內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)核和周圍的周細(xì)胞組成的微血管的相位對(duì)比顯微圖（白色箭頭）,。e.NG2免疫過氧化物酶染色突出顯示周細(xì)胞。f.主動(dòng)脈來源的巨噬細(xì)胞的免疫熒光圖像,；在背景中可見一個(gè)植物凝集素IB4標(biāo)記的內(nèi)皮芽,。g.內(nèi)皮細(xì)胞(IB4)和周細(xì)胞(αSMA)雙染色的微血管共聚焦圖像。

(5)腫瘤微血管密度及腫瘤中的組織病理學(xué)生長模式

微血管密度(MVD)常被認(rèn)為是腫瘤血管生成的替代標(biāo)志物,。組織病理學(xué)生長模式(HGPs)是根據(jù)腫瘤與周圍正常組織界面處的形態(tài)學(xué)特征來定義的,。

非血管生成腫瘤的流行及其對(duì)抗VEGF治療的耐藥性需要識(shí)別一種準(zhǔn)確反映這種類型腫瘤生長的生物標(biāo)志物。HGPs是一個(gè)很好的候選生物標(biāo)志物,。用泛內(nèi)皮抗體免疫染色的腫瘤切片上的血管模式和使用標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞參與新生血管生成的抗體是其他潛在的區(qū)分非血管生成和血管生成腫瘤的組織病理學(xué)方法,。通過CD31對(duì)正常肝（a）組織,、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（b）和（c）組織進(jìn)行染色,，通過不同方法計(jì)算微血管密度模式,，發(fā)現(xiàn)與血管生成、結(jié)締組織增生的肝轉(zhuǎn)移形成對(duì)比,，后者顯示的血管熱點(diǎn)數(shù)量明顯高于正常肝組織和非血管生成的肝組織（如圖12）,。

圖12.微血管密度和組織病理學(xué)生長模式a.正常肝臟中血管模式的無監(jiān)督空間建模顯示，每個(gè)血管輪廓的簇?cái)?shù)量很低,。b.具有替代生長模式的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的血管模式的無監(jiān)督空間建模顯示,，每個(gè)血管輪廓的簇?cái)?shù)量較低。c.對(duì)具有結(jié)締組織生長模式的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的血管模式的無監(jiān)督空間建模顯示,，每個(gè)血管輪廓中都有大量的簇,。a-c.相同的顏色表示相同的微血管密度模式。d.結(jié)締組織生長模式,、替代生長模式和正常肝臟的標(biāo)準(zhǔn)化血管物體簇的數(shù)量的Tukey箱形圖,。

(6)腸套疊血管生成試驗(yàn)

血管生成是血管的從頭形成，可以跟隨發(fā)芽或非發(fā)芽的過程,。一個(gè)重要的非發(fā)芽機(jī)制是腸套疊（自身生長,；也稱為血管分裂）。

血管鑄造已被廣泛用于三維顯示腸套疊血管生成,。該方法是基于創(chuàng)建一個(gè)微血管系統(tǒng)的血管復(fù)制品,。采用甲基丙烯酸甲酯或PU4ii作為鑄造介質(zhì)，灌注后幾小時(shí),，切除器官,，轉(zhuǎn)移到15%的KOH中2-4周，以溶解組織,。洗滌后,，鑄件在一系列不斷增加的乙醇濃度中脫水，并在真空干燥器中干燥,，并用掃描電鏡檢測(cè)（如圖13）,。

圖13.腸套疊血管生成—方法上的挑戰(zhàn)。a.掃描電鏡觀察血管的管腔（星號(hào)）的形成,。b.對(duì)再生斑馬魚鰭血管系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)體內(nèi)觀察顯示了一個(gè)新形成的柱（矩形）,。c.來自b圖的三維重建模型。d.透射電鏡顯微圖顯示了在超微結(jié)構(gòu)水平上的腔內(nèi)組織柱（b,，c中的矩形）,。黑色星號(hào)表示柱狀細(xì)胞的核心，箭頭表示內(nèi)皮細(xì)胞(EC)之間的細(xì)胞-細(xì)胞接觸,。

(7)血管內(nèi)皮生長因子c (VEGFC)的體內(nèi)萌芽淋巴管生成實(shí)驗(yàn)及AAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

淋巴系統(tǒng)在體內(nèi)維持組織液穩(wěn)態(tài),、脂質(zhì)吸收和免疫細(xì)胞運(yùn)輸中起著關(guān)鍵作用,。指導(dǎo)淋巴細(xì)胞生長的最重要的受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是VEGF-C/VEGFR-3系統(tǒng)。通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)或病毒基因傳遞系統(tǒng)提高VEGF-C的組織濃度會(huì)導(dǎo)致淋巴過度生長,。研究淋巴管生成的技術(shù)有耳海綿試驗(yàn)和病毒基因傳遞技術(shù)（如圖14）.

圖14.體內(nèi)淋巴管和血管的生長,。a-c.淋巴管生成的明膠海綿的制備。d-f.AAV的制備和骨骼肌的轉(zhuǎn)染,。

(8)人內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞無血清3D共培養(yǎng)

該分析模型的主要好處和優(yōu)勢(shì)在于其高再現(xiàn)性和高重復(fù)數(shù),，因?yàn)樗窃诎朊娣e96孔板中進(jìn)行的。周細(xì)胞招募到EC管的結(jié)果可以通過檢查基底膜沉積（通過免疫熒光染色或透射電子顯微鏡）,，或通過測(cè)量毛細(xì)管的寬度和長度來揭示,。最后，實(shí)時(shí)視頻分析可以用于監(jiān)測(cè)周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),，因?yàn)樗鼈冊(cè)谌S基質(zhì)中與異常招募的周細(xì)胞共同組裝形成管狀網(wǎng)絡(luò)（如圖15）,。

圖15.人內(nèi)皮細(xì)胞-周細(xì)胞管與3D膠原基質(zhì)共組裝的無血清培養(yǎng)體系。120h固定的培養(yǎng)物用CD31,、層粘連蛋白(LM)和纖維連接蛋白(FN)的抗體進(jìn)行免疫染色,，并用共聚焦顯微鏡成像或透射電鏡檢查。箭頭表示毛細(xì)血管基底膜,。L表示管腔,，Nuc表示細(xì)胞核標(biāo)記。

(9)內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)球體實(shí)驗(yàn)

體外2D單層細(xì)胞培養(yǎng)及其向臨床環(huán)境的轉(zhuǎn)化/延伸的研究有其局限性,，因?yàn)樗鼈儾荒苣M體內(nèi)環(huán)境中的營養(yǎng)和氧梯度,。臨床前3D共培養(yǎng)球體分析有助于細(xì)胞內(nèi)/細(xì)胞間串?dāng)_模擬體內(nèi)血管結(jié)構(gòu)，例如管腔形成和極化,，并且在兩種或多種細(xì)胞類型具有自然粘附和分層特性的情況下,，對(duì)于探索這些相互作用特別有價(jià)值。

多細(xì)胞三維球狀體可以通過多種方法生成,，包括：（1）使用（超）低結(jié)合板自發(fā)形成球狀體,；（2）“吊墜"技術(shù)；（3）懸浮培養(yǎng)（例如,，通過旋轉(zhuǎn)燒瓶或生物反應(yīng)器）,；（4）基于支架的模型（例如，水凝膠）,；（5）磁力懸浮技術(shù),。其中自發(fā)球體形成和懸滴法的方法是比較經(jīng)濟(jì)有效的（如圖16）。

圖16.EC共培養(yǎng)球體測(cè)定,。a.懸滴球狀體生長試驗(yàn)隨時(shí)間的變化的過程概述,。在開始共培養(yǎng)之前，腫瘤細(xì)胞（綠色）先建立自己的微球狀體,，然后在72小時(shí)后引入內(nèi)皮細(xì)胞（紅色）,，并在14天內(nèi)監(jiān)測(cè)它們的摻入情況,。7天后，腫瘤球細(xì)胞球狀體可以通過各種技術(shù)進(jìn)行定量和定性評(píng)估,，如c（熒光）顯微鏡,、組織學(xué)、功能分析或植入體內(nèi),。

(10)內(nèi)皮細(xì)胞代謝實(shí)驗(yàn)

大多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)保持?jǐn)?shù)年的靜息狀態(tài),，但在暴露于促血管生成刺激(如VEGF)時(shí),，它們可以在健康和疾病狀態(tài)下迅速轉(zhuǎn)換為增殖和遷移狀態(tài),。在這種轉(zhuǎn)換的基礎(chǔ)上，是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的代謝網(wǎng)絡(luò),，為內(nèi)皮細(xì)胞做出相應(yīng)反應(yīng)提供必要的能量和構(gòu)建模塊,。目前已建立的監(jiān)測(cè)EC代謝活性的方法有:(1)示蹤劑代謝組學(xué)，(2)基于放射性示蹤劑的代謝測(cè)定,，(3)通過海馬XF分析儀測(cè)量細(xì)胞外酸化率和線粒體呼吸,。如圖17。

圖17.用放射性示蹤劑和海馬XF分析儀測(cè)定EC代謝,。a.用葡萄糖測(cè)量糖酵解通量的示意圖,。b.改良糖酵解應(yīng)力試驗(yàn)的示意圖。c.改進(jìn)的海馬細(xì)胞線粒體應(yīng)力試驗(yàn)示意圖,。

(11)微流控分析

微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的使用改變了我們研究和處理活細(xì)胞的方式,，許多研究人員利用這些系統(tǒng)來推進(jìn)和完善我們對(duì)血管生成和微血管功能的理解。用于研究血管生成的首端微流控細(xì)胞培養(yǎng)模型已經(jīng)成功地結(jié)合了血管功能定量分析,、體外流動(dòng)室,、微制造技術(shù)和3D組織支架的原理。因此,，微流控方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了很好地控制化學(xué)梯度,、流體流動(dòng)、基質(zhì)組成和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用水平,，所有這些都可以整合起來,，為研究血管生成提供生理學(xué)相關(guān)的背景（如圖18）。

圖18.分析血管生成的PDMS微流控裝置,。

(12)流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞分選分析

癌細(xì)胞改變?cè)l(fā)部位的微環(huán)境,，有利于腫瘤的生長和擴(kuò)散。腫瘤微環(huán)境(TME)由許多不同類型的細(xì)胞組成,。腫瘤血管生成通過提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),、細(xì)胞因子和生長因子（血管分泌效應(yīng)），以及傾向轉(zhuǎn)移的逃逸途徑,，促進(jìn)局部腫瘤的生長和侵襲,。在對(duì)腫瘤產(chǎn)生的因子的反應(yīng)中,，被招募的CD11b+髓系細(xì)胞向另一種激活狀態(tài)(M2)極化，而不是經(jīng)典的激活狀態(tài)(M1),。M2極化的CD11b+細(xì)胞通過釋放生長和運(yùn)動(dòng)因子,，包括VEGF、FGF,、腫瘤壞死因子(TNF),、血小板源性生長因子(PDGF)和趨化因子，促進(jìn)腫瘤生長,、侵襲,、轉(zhuǎn)移和血管生成。

傳統(tǒng)上,，TME是通過組織切片的免疫組織學(xué)染色來分析,。雖然組織學(xué)技術(shù)在渲染組織形態(tài)方面具有優(yōu)勢(shì)，但它們也有一些相關(guān)的局限性：（1）檢測(cè)指標(biāo)有限,；（2）染色細(xì)胞無法用于進(jìn)一步分析,；（3）對(duì)于大量樣本，費(fèi)時(shí)費(fèi)力,；（4）無法對(duì)細(xì)胞數(shù)量和染色信號(hào)強(qiáng)度精確定量,。而流式細(xì)胞術(shù)可以規(guī)避組織染色的局限性。如圖19所示,。

圖19.流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)的代表性流程圖,。

(13)雞胚胎的尿囊絨膜實(shí)驗(yàn)（CAM）

盡管Rous 和 Murphy在1911報(bào)道了雞絨毛尿囊膜(CAM)分析法，以研究哺乳動(dòng)物腫瘤的異種生長,，雞胚胎本身一直是從亞里士多德開始的科學(xué)研究的目標(biāo),。由于受精卵很容易獲得，胚胎也很容易可視化,，雞胚胎成為實(shí)驗(yàn)生物學(xué)家最喜歡的目標(biāo),。由于這些*的性能，CAM不僅廣泛應(yīng)用于直接的血管生物學(xué)研究,，還廣泛應(yīng)用于生物工程,、化妝品檢測(cè)、移植生物學(xué),、藥物和疫苗開發(fā),、血管閉塞療法或癌癥研究等。雞胚的絨毛膜尿囊膜實(shí)驗(yàn)如圖20所示,。

圖20.雞胚的絨毛膜尿囊膜試驗(yàn)（CAM）,。

更多血管生成相關(guān)實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)參考文獻(xiàn)“Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays",。
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參考文獻(xiàn)：
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