信使 RNA (mRNA) 等外源性分子介導(dǎo)的生物療法,，其應(yīng)用面臨的一個(gè)主要障礙就是其免疫原性，因?yàn)轶w外合成的 mRNA 具有較高的免疫原性,，可能會(huì)誘發(fā)大量炎癥反應(yīng),，不僅無(wú)法取得預(yù)期的治療效果，還會(huì)引起強(qiáng)大的副作用,。關(guān)于如何降低體外合成mRNA分子的免疫原性,，在過(guò)去的十幾年中，科學(xué)家們進(jìn)行了大量相關(guān)研究,，其中,，較為重要的發(fā)現(xiàn)之一就是多種修飾核苷酸，而含有各種修飾核苷酸的 mRNA,，如假尿苷和N-6-甲基腺苷,，可以有效降低mRNA的免疫原性，抑制先天免疫激活,，使 mRNA可能成為再生醫(yī)學(xué),、疾病治療和細(xì)胞重編程的有力工具。
迄今為止,，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證的多種核苷酸化學(xué)修飾策略可以降低免疫原性而不影響其翻譯特性,，例如將天然腺苷替換為N1-甲基腺苷（m1A）或N6-甲基腺苷（m6A）；替換天然胞嘧啶核苷為5-甲基胞嘧啶核苷（m5C）,；以及將天然尿苷替換為5-甲氧基尿苷（5moU）,，假尿苷（ψ）或N1-甲基假尿苷（m1ψ）等。其中,，m5C和ψ備受關(guān)注,，因?yàn)闊o(wú)論是體內(nèi)還是體外都表明，它們?cè)谟行Ы档蚼RNA免疫原性的同時(shí),，也顯著提高了其翻譯效率,。
圖1：mRNA的化學(xué)修飾匯總[1]
一、核苷酸修飾簡(jiǎn)介
1,、Pseudo-UTP (Ψ)
假尿苷（Pseudouridine）是RNA上豐富的修飾核苷,，又被稱為RNA的“第五種核苷"。mRNA 假尿嘧啶化修飾的過(guò)程是由假尿嘧啶合成酶進(jìn)行催化,，讓尿嘧啶核苷酸（U）化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,，形成假尿嘧啶核苷酸,。已有的研究表明，mRNA 的假尿嘧啶化修飾主要有三個(gè)功能：改變密碼子,、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性和應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答,。2005年，Katalin Karikó等人發(fā)現(xiàn)將假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性,，并且RNA的免疫原性隨著假尿苷引入比例的增高而降低[2],。2008年，Katalin Karikó等人還發(fā)現(xiàn)用假尿苷*替代尿苷的mRNA不僅能極大地降低mRNA的免疫原性,，還能提高mRNA的穩(wěn)定性并增強(qiáng)其翻譯能力[3],。
2、N1-Methylpseudo-UTP (mΨ)
N1-methyl-pseudouridine 是一種甲基假尿苷,，通過(guò)增加核糖體密度,，mRNA 中的 N1-methyl-pseudouridine 以 eIF2α 依賴性和獨(dú)立機(jī)制增強(qiáng)翻譯。2015年,，Oliwia Andries等人發(fā)現(xiàn)用N1-甲基假尿苷*替代尿苷比用假尿苷*替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性,，且更能增強(qiáng)mRNA的蛋白表達(dá)能力[4]。
3,、N6-Methyl-ATP（m6A）
早在 20 世紀(jì) 70 年代,，科學(xué)家們就在 RNA 中發(fā)現(xiàn)了 m6A 修飾，但其功能則由于技術(shù)制約一直未能被很好的揭示,。直到 2012 年,，科學(xué)家們的研究表明，m6A 修飾和mRNA 的穩(wěn)定性,、剪接加工,、翻譯以及 microRNA 的加工有關(guān)[5,6]。 2018年,，Shinichiro Akichikade等人還發(fā)現(xiàn)在5'-加帽的mRNA帽子上含有92% 的m6Am和8%的Am,，可促進(jìn)mRNA的翻譯[7]。
4,、5-Methyl-CTP (5mC)
在 mRNA 中,，m5C 修飾連同多種效應(yīng)酶，例如 NOP2/Sun RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 2 (NSUN2),、NSUN6,38 tRNA 天冬氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 1 (TRDMT1) 和 Aly/REF 輸出因子 (ALYREF),，執(zhí)行多種功能， 包括促進(jìn) mRNA 核胞質(zhì)運(yùn)輸,；病毒蛋白表達(dá),； DNA損傷修復(fù)；mRNA 穩(wěn)定性；細(xì)胞耐受性,、增殖和遷移,；干細(xì)胞的發(fā)育、分化和重編程,； mRNA 剪接的調(diào)控[8],。此外,，m5C的分布因細(xì)胞類型而異,。在mRNA的特定位置上的m5C修飾表現(xiàn)出不同的調(diào)控活性:它們可以促進(jìn)或抑制翻譯[9]。
5,、5-Methoxy-UTP(5moU)
5-甲氧基尿苷(5moU) 是一種罕見的核苷,，存在于tRNA中。它由β- D-核糖尿嘧啶（糖）和核堿基 5-甲氧基尿嘧啶組成,，是尿苷的衍生物,。RNA (mRNA) 中加入 5-甲氧基尿苷可以降低所得mRNA 的免疫原性。2022年,，Hanieh Moradian等人發(fā)現(xiàn)尿苷的化學(xué)修飾,，特別是5moU，顯示出高水平的蛋白質(zhì)產(chǎn)生,，而對(duì)炎性巨噬細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)可忽略不計(jì)[10],。
二、核苷酸修飾應(yīng)用案例
圖2：mRNA的化學(xué)修飾能夠顯著改善表達(dá),，但因細(xì)胞類型和編碼序列而異[1]
| 核苷酸修飾類型 | 功能/應(yīng)用 |
| Ψ,、mΨ[11] | 用N1-甲基假尿苷*替代尿苷比用假尿苷*替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增強(qiáng)mRNA的蛋白表達(dá)能力 |
| mΨ[12,13] | Moderna 疫苗（mRNA-1273）和BioNTech 疫苗（BNT162b） |
| m6A,、Ψ,、mΨ、2FdU,、5mC,、5hmC、5moC和2 2FdC[14] | 與未修飾的 mRNA 相比,，具有修飾核苷酸的每種 mRNA 減少了 IFN-β 的產(chǎn)生, 逃避或抑制先天性免疫信號(hào) |
| ψ,、mψ、5mC/ψ,、5hmC/5mU 和 5moC/5mU[15] | 五種修飾的FLuc mRNA（ψ,、mψ、5mC/ψ,、5hmC/5mU 和 5moC/5mU-FLuc mRNA）顯著優(yōu)于未修飾的 FLuc mRNA 的活性,。 |
| Mψ、5moU、ψ[16] | mRNA的化學(xué)修飾能夠顯著改善蛋白質(zhì)表達(dá),，這取決于細(xì)胞類型和編碼序列,。具有mψ、5moU和ψ修飾的eGFP mRNAs在測(cè)試的細(xì)胞系中表達(dá)前三,。5moU 修飾的 eGFP mRNA 比其他 eGFP mRNA更穩(wěn)定,。 |
愛必信提供以下幾種修飾核苷酸
| 修飾堿基 | 類型 | 特點(diǎn) |
| 假尿苷（Pseudo-UTP；Ψ）,、 | 提高mRNA的穩(wěn)定性,、提升翻譯效率、降低免疫原性 | |
| N1-甲基-假尿苷（N1-Methylpseudo-UTP） | ||
| 5-甲基-胞苷三磷酸 （5-Methyl-CTP） | ||
| 5-甲氧基-尿苷三磷酸(5-Methoxy-UTP) | ||
| N6-甲基-腺苷三磷酸(m6A,N6-Methyl-ATP) |
修飾核苷酸產(chǎn)品列表
| 貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 |
| abs60188 | 5-甲氧基-CTP鋰鹽溶液 | 10μL/50μL/1mL |
| abs60169 | 5-甲氧基-UTP鈉鹽溶液 | 10μL/50μL/1mL |
| abs60189 | 5-甲氧基-UTP鋰鹽溶液 | 10μL/50μL/1mL |
| abs60168 | 5-甲基-CTP鈉鹽溶液 | 10μL/50μL/1mL |
| abs60159 | ATP Sodium salt solution（100 mM） | 1ml×3 |
| abs60163 | CTP Sodium salt solution（100 mM） | 1ml×3 |
| abs60164 | GTP Sodium salt solution（100 mM） | 1ml×3 |
| abs60165 | UTP Sodium salt solution（100mM） | 1ml×3 |
| abs60186 | N1-甲基-假尿苷三磷酸四鋰鹽溶液/N1-Methyl-Pseudo-UTP | 10ul/50ul/1mL |
| abs60156 | N1-甲基-假尿苷三磷酸四鈉鹽溶液/N1-Methyl-Pseudo-UTP | 10ul/50ul/1mL |
| abs60187 | N6-甲基-ATP鋰鹽溶液 | 10ul/50ul |
| abs60158 | NTP 鈉鹽混合溶液（含ATP,、CTP,、GTP、UTP） | 1ml×3 |
| abs60185 | 假尿苷三磷酸四鋰鹽溶液/Pseudo-UTP, lithium salt solution | 10ul/50ul/1ml |
| abs60155 | 假尿苷三磷酸四鈉鹽溶液/Pseudo-UTP, Sodium salt solution | 10ul/50ul/1ml |
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