Marker,,染色及內(nèi)參等相關(guān)問題
Q:用的是預(yù)染marker,但是電泳總跑不全8條帶,,請問什么原因,?怎樣改善,?膠用過8%,10%,,12%,,都是這樣。marker是新買的,。
A:一般來說,,是小分子量Marker跑走了,可以增加膠濃度或減少電泳時間,。梯度膠也是不錯的選擇,。(梯度凝膠愛必信就可提供呦)
Q:Western Blot哪種染色好?
A:(1)陰離子染料是zui常用的,,特別是氨基黑,,脫色快,背景低檢測極限可達到1.5μg,,考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度,,但脫色慢,,背景高,。麗春紅S 和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去 ,以便進行隨后的氨基酸分析,。缺點是:溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞,。不能用于正電荷的膜。靈敏度低,。
(2)膠體金,,靈敏度高,檢測范圍可到pg級,,但染色比穩(wěn)定,。
(3)生物素化靈敏度位于1、2之間,,可用于任何一種膜,。
Q:是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參?
A:對于發(fā)表文章的實驗一定要加內(nèi)參,,實驗嚴謹,。
Q:用BANDSCAN分析結(jié)果行嗎?
A:分析一般的結(jié)果沒問題,。
Q: 核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適,?
A:可以選用組蛋白,組蛋白在細胞核中的表達是很穩(wěn)定的,,有很多都可以當成內(nèi)參,,在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。
Q:轉(zhuǎn)膜時采用電流是否比電壓準確,是否根據(jù)0.8mA/cm2,,一般1小時左右,?
A:不是的, 半干法推薦用恒流,,一般根據(jù)目的蛋白的大小來確定電流和時間,,一般蛋白越大,轉(zhuǎn)膜所需時間就越長,。
Q:封閉,,一抗,二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢,,比如現(xiàn)在我就在室溫里做,,或者要在4度下?
A:均可在室溫進行,如果時間不夠,,一抗孵育可以先在室溫進行一個小時,,然后4度過夜。
Q: PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么,?
A:一般而言,,硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián),這樣的話,,反復(fù)洗幾次后,,蛋白容易掉下來,結(jié)果較差,。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合 (注:常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜),,同時也有疏水作用,但相對較弱,。這樣的話,,PVDF膜和蛋白接合較牢,不易脫落,,結(jié)果較好,。
Q:酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等?
A:NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,,一般建議添加,。
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