Marker，染色及內(nèi)參等相關(guān)問題
Q：用的是預(yù)染marker,，但是電泳總跑不全8條帶,，請問什么原因？怎樣改善,？膠用過8％,，10％，12％,，都是這樣,。marker是新買的。
A：一般來說,，是小分子量Marker跑走了,，可以增加膠濃度或減少電泳時間。梯度膠也是不錯的選擇,。（梯度凝膠愛必信就可提供呦）
Q：Western Blot哪種染色好,？
A：（1）陰離子染料是zui常用的，特別是氨基黑,，脫色快,，背景低檢測極限可達到1.5μg，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度,，但脫色慢,，背景高。麗春紅S 和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進行隨后的氨基酸分析,。缺點是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞,。不能用于正電荷的膜。靈敏度低,。
（2）膠體金，靈敏度高,，檢測范圍可到pg級,，但染色比穩(wěn)定。
（3）生物素化靈敏度位于1,、2之間,，可用于任何一種膜。
Q：是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參,？
A：對于發(fā)表文章的實驗一定要加內(nèi)參,，實驗嚴謹。
Q：用BANDSCAN分析結(jié)果行嗎,？
A：分析一般的結(jié)果沒問題,。
Q: 核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？
A：可以選用組蛋白,，組蛋白在細胞核中的表達是很穩(wěn)定的,，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參,。
Q：轉(zhuǎn)膜時采用電流是否比電壓準確,，是否根據(jù)0.8mA/cm2，一般1小時左右,？
A：不是的,， 半干法推薦用恒流，一般根據(jù)目的蛋白的大小來確定電流和時間,，一般蛋白越大,，轉(zhuǎn)膜所需時間就越長。
Q：封閉,，一抗,，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如現(xiàn)在我就在室溫里做,，或者要在4度下?
A：均可在室溫進行，如果時間不夠,，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時,，然后4度過夜。
Q： PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么,？
A：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián),，這樣的話，反復(fù)洗幾次后,，蛋白容易掉下來,，結(jié)果較差,。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合 （注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用,，但相對較弱。這樣的話,，PVDF膜和蛋白接合較牢,，不易脫落,，結(jié)果較好。
Q：酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等,？
A：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,，一般建議添加。
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