Marker，染色及內參等相關問題
Q：用的是預染marker,，但是電泳總跑不全8條帶,，請問什么原因？怎樣改善,？膠用過8％，10％,，12％,，都是這樣。marker是新買的,。
A：一般來說,，是小分子量Marker跑走了，可以增加膠濃度或減少電泳時間,。梯度膠也是不錯的選擇,。（梯度凝膠愛必信就可提供呦）
Q：Western Blot哪種染色好？
A：（1）陰離子染料是zui常用的,，特別是氨基黑,，脫色快，背景低檢測極限可達到1.5μg,，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度,，但脫色慢，背景高,。麗春紅S 和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去 ,，以便進行隨后的氨基酸分析,。缺點是：溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用于正電荷的膜,。靈敏度低,。
（2）膠體金，靈敏度高,，檢測范圍可到pg級,，但染色比穩(wěn)定。
（3）生物素化靈敏度位于1,、2之間,，可用于任何一種膜。
Q：是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內參,？
A：對于發(fā)表文章的實驗一定要加內參,，實驗嚴謹。
Q：用BANDSCAN分析結果行嗎,？
A：分析一般的結果沒問題,。
Q: 核內抗原Western Blot內參選擇什么合適？
A：可以選用組蛋白,，組蛋白在細胞核中的表達是很穩(wěn)定的,，有很多都可以當成內參，在網上查查就可以選出你要的內參,。
Q：轉膜時采用電流是否比電壓準確,，是否根據0.8mA/cm2，一般1小時左右,？
A：不是的,， 半干法推薦用恒流，一般根據目的蛋白的大小來確定電流和時間,，一般蛋白越大,，轉膜所需時間就越長。
Q：封閉,，一抗,，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如現在我就在室溫里做,，或者要在4度下?
A：均可在室溫進行,，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時,，然后4度過夜,。
Q： PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？
A：一般而言,，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯,，這樣的話,，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來,，結果較差,。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合 （注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用,，但相對較弱,。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢,，不易脫落,，結果較好。
Q：酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等,？
A：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,，一般建議添加。
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