參數(shù)規(guī)格：
產(chǎn)品名稱：兔粘液瘤病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Rabbit Myxomatosis Virus(RMV)
產(chǎn)品規(guī)格：50T
產(chǎn)品運輸：低溫運輸
產(chǎn)品保存：-20℃保存
產(chǎn)品有效期：一年
產(chǎn)品特點：本產(chǎn)品就是根據(jù)保守區(qū)設(shè)計引物而開發(fā)的高靈敏熒光定量 PCR 產(chǎn)品,。
運輸及保存
低溫運輸,，-20℃保存,，保存期限一年,。
自備試劑
DNA模板,、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）,。
產(chǎn)品及特點：
1. 即開即用,，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)鮑皰疹樣病毒探針法熒光定量保守序列設(shè)計的專一性引物,，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng),。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量PCR檢測,，避免后續(xù)污染,。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷,。

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實驗過程：
一、兔粘液瘤病毒探針法熒光定量PCR試劑盒試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．產(chǎn)品僅用于科研對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中,，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,，而不能從無到有，憑空合成,。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物,。可以是DNA也可以是RNA,，一般20多bp,，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此,，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP,、dCTP、dGTP,、dTTP各2mM
5．Taq酶
二,、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中,。
      10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μl
      Taq酶（2U/μl）            1μl
      DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
     加ddH2O至               50 μl
     視PCR儀有無熱蓋,，不加或添加石蠟油,。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴增,。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次,，后在72℃ 保溫7min,。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油,，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油,；否則,，直接取5-10μl電泳檢測。
使用方法：
一,、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DN段作為陽性對照,。
2. 標(biāo)記6個離心管,，分別為7，6,，5,，4，3,，2,。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）,。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照,，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。
5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用,。
6. 換槍頭,，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照,。放冰上待用,。
二,、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取,，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照）,，一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL,，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為PC,。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,，則PC和NC的體積也必須是200μL,。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容,。
三,、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進行）
10. 如果只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照,，6個用于PCR陽性對照,。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍,。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好,。
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