實驗過程：
一,、細小病毒19探針法熒光定量PCR試劑盒試劑準備
1. DNA模板
2．產品僅用于科研對應目的基因的特異引物（在PCR反應中,，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制,，而不能從無到有，憑空合成,。這一小段序列就是你所要有設計的引物,。可以是DNA也可以是RNA,，一般20多bp,，需要根據(jù)你的模板鏈設計,。因此,，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP,、dGTP,、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中,，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中,。
      10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μl
      Taq酶（2U/μl）            1μl
      DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
     加ddH2O至               50 μl
     視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油,。
2．調整好反應程序,。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴增,。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次,，后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應,，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,，以除去石蠟油,；否則，直接取5-10μl電泳檢測,。
參數(shù)規(guī)格：
產品名稱：細小病毒19探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Parvovirus B19(PVB19)B19
產品規(guī)格：50T
產品運輸：低溫運輸
產品保存：-20℃保存
產品有效期：一年
產品特點：本產品就是根據(jù)保守區(qū)設計引物而開發(fā)的高靈敏熒光定量 PCR 產品,。
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存,，保存期限一年,。
自備試劑
DNA模板、10×ROX（根據(jù)機型決定,，具體見使用方法）,。
本產品只適用于科研,，不能用于臨床診斷。

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產品及特點：
1. 即開即用,，用戶只需要提供病毒樣品,。
2. 根據(jù)鮑皰疹樣病毒探針法熒光定量保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應,。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應,。
4. 一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染,。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應體系的熒光定量PCR,。
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使用方法：
一,、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供可以直接使用的DN段作為陽性對照,。
2. 標記6個離心管，分別為7,，6,，5，4,，3,，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）,。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
5. 換槍頭,，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。
6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照,。放冰上待用,。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品,，必須設置N+2個提取,，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL,，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為PC。另外用水作為NC,。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL,。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三,、設置qPCR反應（20 μL體系,，在樣品制備室進行）
10. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照,。如果做2-3次重復,，則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復,。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好。