一、原代細(xì)胞培養(yǎng)(一)原理細(xì)胞培養(yǎng)(Cellculture)是模擬機體內(nèi)生理條件,，將細(xì)胞從機體中取出,，在人工條件下使其生存、生長,、繁殖和傳代,，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變,、細(xì)胞工程等問題的研究,。近年來，廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué),、遺傳學(xué),、免疫學(xué)、腫瘤學(xué),、細(xì)胞工程等領(lǐng)域,，發(fā)展成一種重要生物技術(shù)，并取得顯著成就,。由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng),。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時間短，性狀與體內(nèi)相似,，適用于研究,。一般說來,，幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞，如：動物的胚胎,、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng),。(二)操作1．取材用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后,，把整個動物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒,，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚,，剖腹取出肝臟或腎臟,。置于無菌平皿中。2．切割用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次,，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎,，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗,，洗到組織塊發(fā)白為止,。移入無菌離心管中，靜置數(shù)分鐘,，使組織塊自然沉淀到管底,，棄去上清。3．消化,、接種培養(yǎng)吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml,，加入離心管中，與組織塊混勻后,，加上管口塞子,，37℃水浴中消化8～10分鐘，每隔幾分鐘搖動一下試管,，使組織與消化液充分接觸,，靜止，吸去上清,，向離心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培養(yǎng)基，用吸管吹打混勻,，移入二個培養(yǎng)瓶中,，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(三)結(jié)果細(xì)胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁,，并開始生長,，如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層,。二,、傳代細(xì)胞培養(yǎng)(一)原理體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代,，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù),。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后,，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散,，從容器中取出,，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng),。細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間,，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中,，細(xì)胞培增3～6次,。細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過三個階段：游離期,、指數(shù)增生期和停止期,。常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)／100個細(xì)胞,。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％,，腫瘤細(xì)胞可達(dá)3～5％。細(xì)胞接種2～3天分裂增殖旺盛,，是活力時期,，稱指數(shù)增生期(對數(shù)生長期)，適宜進(jìn)行各種試驗,。(二)操作1．將長成單層的原代培養(yǎng)細(xì)胞或HeLa細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出,，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液,。(以液面蓋住細(xì)胞為宜),，靜置5～10分鐘。2.在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞,，如果細(xì)胞變園,，相互之間不再連接成片，這時應(yīng)立即在超凈臺中將消化液倒掉,，加入3～5ml新鮮培養(yǎng)液,，吹打，制成細(xì)胞懸液,。3．將細(xì)胞懸液吸出2ml左右,，加到另一個培養(yǎng)瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞,，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中,，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),。(三)結(jié)果一般情況，傳代后的細(xì)胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上,，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層,，需要再次進(jìn)行傳代。三,、器材及液體的準(zhǔn)備和無菌操作的注意事項(一)器材和液體的準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材,，如：培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后,，裝在鋁盒和鐵筒中,，120℃，2小時干烤滅菌后備用,；手術(shù)器材,、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅,，20分鐘蒸氣滅菌,；mem培養(yǎng)液、小牛血清,、消化液用G6濾器負(fù)壓抽濾后備用,。(二)無菌操作中的注意事項在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔,。為此,，在操作前要認(rèn)真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分鐘起動超凈臺吹風(fēng),。操作時,，嚴(yán)禁說話，嚴(yán)禁用手直接拿無菌的物品,，如瓶塞等,，而要用器械，如止血鉗,、鑷子等去拿,。培養(yǎng)瓶要在超凈臺內(nèi)才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒,，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下,，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內(nèi)完成。操作完畢后,，加上瓶塞，才能拿到超凈臺外,。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端,，將在火上燒一下，戴上膠皮乳，然后再去吸取液體,?？傊?strong>原代細(xì)胞在整個無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行,。