原代細胞實驗試劑
1. 細胞營養(yǎng)液（DMEM液體培養(yǎng)基,，10％胎牛血清,，雙抗100單位/ml），消化液（0.05％胰酶,，0.53mM EDTA·Na）,，Hank’s液。
2. 2×HBS液（280mMNaCl, 10mMKCl, 1.5mMNaHPO4·2H2O, 12mM葡萄糖,，50mMHepes,，pH7.05, 0.2μ過濾除菌），CaCl2（2.5M,，0.2μ過濾除菌）溶液,，超純水（滅菌）。
3. PBS,，蛋白酶K,，NP40，RNaseA,，無水乙醇,，酚，DNA上樣緩沖液,，瓊脂糖,，TAE電泳緩沖液，EB,。
實驗設備
1. 10cm細胞培養(yǎng)皿
2. 50ml、15ml一次性離心管
3. 10ml玻璃吸管（滅菌）,，與玻璃吸管配套的吸球及膠管
4. 二氧化碳培養(yǎng)箱
5. 倒置顯微鏡
6. 20μl,，200μl微量移液器
7. 1.5ml離心管（滅菌）
8. 200μl微量移液器頭
9. 1ml微量移液器
10. 低速臺式離心機
11. 高速臺式離心機
12. 4°C，－20°C冰箱
13. DNA凝膠電泳設備
14. 紫外凝膠成像儀
實驗材料
胚腎細胞系293,，TNF－R1哺乳動物細胞表達質粒（CsCl超速離心純）,，哺乳動物細胞表達載體（CsCl超速離心純）。
實驗步驟
1. 293細胞的傳代培養(yǎng)（*天） 
   1） 顯微鏡觀察母細胞的生長狀態(tài),，確定傳代比例,。 
為了獲得較高的轉染效率，必需保證細胞處于合適的生長密度,，因此應根據母細胞的生長密度調整傳代比例,。磷酸鈣轉染的合適細胞密度為50％－70%,，本實驗中使用的293細胞長成致密單層后一般按照1：6傳代即可。 
   2） 在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿蓋,，倒去皿中的細胞營養(yǎng)液,，加入2mlHank’s液，輕輕搖動,，將溶液倒出,。 
   3） 消化與分裝。 
在培養(yǎng)皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液）,，37°C靜置5分鐘左右,，顯微鏡觀察，如果細胞變圓且彼此分離表明消化*,，此時可加入10ml營養(yǎng)液終止消化,，吹打數次，使培養(yǎng)皿壁上的細胞全部脫落下來,，并分散形成均勻的細胞懸液,。按照傳代的比例補加適當體積的營養(yǎng)液，吹打混勻后分裝到新的培養(yǎng)皿中,。 
在分裝好的細胞培養(yǎng)皿上做好標記,，置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 
2. 用磷酸鈣介導的外源質粒轉染法在293細胞中過量表達TNF－R1（第二天） 
   1） 顯微鏡觀察待轉染細胞的生長狀態(tài) 
      a. 觀察細胞是否污染 
      b. 觀察培養(yǎng)液顏色的變化 
      c. 觀察細胞的生長密度 
   2） 轉染 
      a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）質粒DNA（實驗組為TNF-R1的哺乳動物細胞表達載體,，對照組為空載體）,，350μl超純水，40μlCaCl2（2.5M）溶液,，混勻,。 
      b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS，將A液分三次緩慢加入,，每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻,。室溫靜置5分鐘。 
      c. 將A,，B混合液均勻地滴加在待轉染的293細胞培養(yǎng)液中,，輕輕晃動使混勻。將培養(yǎng)皿置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中,。 
3. 凋亡細胞的形態(tài)觀察,，“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析（第三天） 
   1） 顯微鏡觀察過量表達TNF-R1（實驗組）和空載體（對照組）的293細胞形態(tài)上的差異。 
   2） 原代細胞用10ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養(yǎng)皿中的細胞輕輕吹打下來,，收集到15ml離心管中,，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1mlPBS重懸,，轉移到1.5ml離心管中,，2000rpm離心3分鐘,，去除上清液，加入200μlPBS（0.2mg/ml 蛋白酶 K）,，重懸細胞,，再加入200μlPBS（2％NP40），顛倒混勻,，4°C作用30分鐘,，期間顛倒數次。12,000rpm離心2分鐘,，吸出上清,，加入1ml乙醇，顛倒混勻,，－20°C靜置10分鐘,，12,000rpm離心10分鐘，沉淀溶于50μl水中,，加入RNaseA（10mg/ml）,，37°C靜置20分鐘。 
   3） 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液,，取出50μl進行2％瓊脂糖凝膠電泳,，紫外凝膠成像儀拍照。
78-83-1     2-Methyl-1-propanol    2-甲基-1-丙醇標準品    1.2ml×3ampules
67-63-0     2-Propanol     2-丙醇標準品    1.2ml×3ampules
123-51-3     3-Methyl-1-butanol    3-甲基-丁醇標準品    1.2ml×3ampules
100-66-3    Anisole    茴香醚標準品    1.2ml×3ampules
123-86-4    Butyl Acetate    乙酸丁酯標準品    1.2ml×3ampules
98-82-8    Cumene    異丙苯標準品    1.2ml×3ampules
141-78-6    Ethyl Acetate    乙酸乙酯標準品    1.2ml×3ampules
109-94-4    Ethyl Formate    甲酸乙酯標準品    1.2ml×3ampules
64-18-6     Formic Acid     甲酸標準品    1.2ml×3ampules
原代細胞