細(xì)胞系懸液標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)步驟

(1)取材：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于離心管中,，800～1000r／min離心10min,，棄上清，彈指法混勻細(xì)胞,。沿管壁加入2．0％～2．5％冷戊二醛,，輕輕吹打，4℃固定30min,。用小鋁片將細(xì)清,。4℃PBS緩沖液沖洗1～2h或過夜，1000r／min離心5min，棄上清,。

(2)制備預(yù)包埋塊：管內(nèi)加入2％～4％37℃瓊脂糖液0．1～0．5ml,，兩手搓離心管，使細(xì)胞系與瓊脂糖混勻,，室溫冷卻,，形成細(xì)胞瓊脂凝膠預(yù)包埋塊。離心管內(nèi)加適量PBs緩沖液或75％乙醇溶液,，鋁片沿管輕輕地將細(xì)胞瓊脂糖凝膠塊松動(dòng),，預(yù)包埋塊移入含75％乙醇溶液的青霉素瓶?jī)?nèi)，24h后換固定液一次,，4℃保存,，1年內(nèi)使用。

(3)固定：預(yù)包埋塊切成1mm3大小,，置1％鋨酸4℃固定1～2h,。

(4)漂洗與脫水：PBS緩沖液反復(fù)漂洗30min或過夜。分別用50％,、70％,、90％、100％丙酮脫水各1次,，每次10～15min,；100％丙酮脫水3次，每次30min,。

(5)浸透,、包埋與聚合：浸入稀釋包埋劑(丙酮：包埋劑為1：1)中，室溫1h,。再浸入純包埋劑(如環(huán)氧樹脂)中,，37℃過夜。60℃固化48h,。干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)超薄切片：首先將標(biāo)本包埋塊頂端修成近45,。的四邊錐體，使標(biāo)本暴露出來,，切面呈長(zhǎng)寬約為0．4mm～0. 6mm的長(zhǎng)方形或梯形,。然后將其夾在標(biāo)本夾中，固定在切片機(jī)上,。玻璃切片刀需用膠布圍成水槽,，加入適量蒸餾水，使切下的薄片漂在水面,，用覆有支持膜(透明塑膠膜)的載網(wǎng)(銅網(wǎng)或鎳網(wǎng))收集,?？梢愿鶕?jù)薄片與水面反射光所產(chǎn)生的干涉色判斷切片的厚度：以銀白色(50～70nm)為*；薄片大于l00nm(紫紅色),，電子束的穿透較差,，微細(xì)結(jié)構(gòu)辨別不清；但小于40nm(暗灰色)圖像反差低,，難以觀察,。

(7)染色：在平皿中放一片蠟紙，并在其上滴1滴乙酸鈾染液,，用彎頭小鑷子夾住載網(wǎng)邊緣,，把貼有薄片的一面朝下，輕輕插入染液中,，蓋上平皿蓋,，室溫下染色10～20min，雙蒸水清洗2次,；置人枸櫞酸鉛染液中染色15min,，0. 1mol/L NaOH染液漂洗1～2s，雙蒸水清洗2次,。

(8)觀察：切片自然干燥后觀察,。

細(xì)胞系注意事項(xiàng)

(1)鋨酸揮發(fā)性強(qiáng)，有強(qiáng)烈的刺激性氣味且毒性強(qiáng),，易蒸發(fā),，對(duì)皮膚、呼吸道黏膜及眼睛角膜有傷害作用,，因此操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。配制和儲(chǔ)存不當(dāng)會(huì)產(chǎn)生鋨黑,，使其失效,，因此需冷凍、密封和避光保存,，臨用前需*化開,，以免濃度欠佳。

(2)玻璃切片刀現(xiàn)用現(xiàn)做,，通常一把刀切一個(gè)標(biāo)本,。

(3)乙酸鈾染液有微量放射性，能發(fā)熒光,，需小心使用,、避光保存。染色時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光直射,，避免污染皮膚和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面,。

(4)染色時(shí)要注意染液的濃度,、pH和染色時(shí)間等必要條件，使染色的同時(shí)不會(huì)掩蓋精細(xì)結(jié)構(gòu)的層次,。