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當(dāng)前位置:上海研生實(shí)業(yè)有限公司>>技術(shù)文章>>原代細(xì)胞計數(shù)的操作步驟
(一)原代細(xì)胞計數(shù)
1,、將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈,并將蓋片蓋在計數(shù)板上,。
2,、將細(xì)胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,,使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間,。
3、靜置3分鐘,。
4,、鏡下觀察,計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù),,壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的,。然后按下式計算:
細(xì)胞數(shù)/ml=4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000
注意:鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),應(yīng)按單個細(xì)胞計算,,若細(xì)胞團(tuán)占10%以上,,說明分散不好,需重新制備細(xì)胞懸液,。
(二)原代細(xì)胞活力
1,、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。
2,、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液,,染色2一3分鐘。
3,、吸取少許懸液涂于載玻片上,,加上蓋片。
4,、鏡下取幾個任意視野分別計死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù),,計細(xì)胞活力。
死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色,,鏡下可見深蘭色的細(xì)胞,,活細(xì)胞不被染色,鏡下呈無色透明狀,。
活力測定可以和細(xì)胞計數(shù)合起來進(jìn)行,,但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。
(三)MTT法測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力
活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍,。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比,,也與細(xì)胞活力呈正比,。
l、細(xì)胞懸液以1000rpm離心10分鐘,,棄上清液,。
2、沉淀加入0.5-1ml MTT,,吹打成懸液,。
3、37℃下保溫2小時,。
4,、加入4—5 ml酸化異丙醇(定容)。打勻,。
5,、1000 rpm離心,取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計570nm比色,,酸化異丙醇調(diào)零點(diǎn),。
注意:MTT法只能測定原代細(xì)胞相對數(shù)和相對活力,不能測定細(xì)胞數(shù),。
附:1,、0.4%臺盼蘭染液配制:
臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml。
2,、MTT配制:
MTT 0.5克,,溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中。4℃下保存,。
3,、酸化異丙醇配制:
異丙醇中加入HCl使zui終達(dá)0.04mol/L。
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