1,、將抗原和淋巴細(xì)胞系在體外混合，刺激并預(yù)孵育,，是通用的方法,。預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞，在置入ELISPOT板之前應(yīng)使用復(fù)溫到37℃的培養(yǎng)液清洗細(xì)胞1-2次,。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養(yǎng)5～6小時(shí),。

2,、對(duì)于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細(xì)胞和抗原同時(shí)加入ELISPOT板孔中,，37℃培養(yǎng)箱中,，同步進(jìn)行刺激、培養(yǎng),、和細(xì)胞因子捕獲,。淋巴細(xì)胞板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)的時(shí)間通常為22～24小時(shí)。

3,、ELISPOT試驗(yàn)檢測的是每一個(gè)分泌細(xì)胞系因子的活化細(xì)胞,。在培養(yǎng)細(xì)胞過程中，任何移動(dòng),、震動(dòng)（包括開關(guān)培養(yǎng)箱門）都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)板上的移動(dòng),，從而得到不規(guī)則斑點(diǎn)或者斑點(diǎn)花紋，影響zui終結(jié)果,。因此細(xì)胞在ELISPOT培養(yǎng)板孵育的過程中,，應(yīng)注意保持培養(yǎng)板的靜置，不應(yīng)對(duì)其移動(dòng),。

4,、在使用抗原刺激淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃，這種現(xiàn)象通常見于使用很強(qiáng)的多克隆抗原刺激淋巴細(xì)胞,，某些多克隆抗原會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡或者死亡,，大量淋巴細(xì)胞死亡后使培養(yǎng)液變黃。使用這些淋巴細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)ELISPOT試驗(yàn)通常得到很低的斑點(diǎn)（SPOT）形成,。換用特異性抗原后可以避免該現(xiàn)象,。

5、在ELISPOT結(jié)果中出現(xiàn)不規(guī)則的大塊斑點(diǎn),，有的區(qū)域沒有斑點(diǎn)的原因,，不規(guī)則斑點(diǎn)區(qū)域的出現(xiàn)一般是細(xì)胞分離不*所至，有時(shí)候采用多克隆抗原孵育的淋巴細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生成團(tuán)現(xiàn)象,。請(qǐng)確認(rèn)加入到ELISPOT板中進(jìn)行孵育的是單細(xì)胞懸液,。

6、使用開口較大的吸頭,，動(dòng)作輕柔,，避免對(duì)細(xì)胞系的吹打，減少剪切力對(duì)淋巴細(xì)胞的傷害,。