冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下,， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過(guò)1 小時(shí),， 以防止冰晶過(guò)大,，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,，惟存活率稍微降低一些,。

產(chǎn)品屬性：

名稱    兔腸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
2.組織來(lái)源：腸組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡(jiǎn)介：

兔腸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離自腸系膜動(dòng)脈組織；腸道指的是從胃幽門(mén)至的消化管,。腸是消化管中最長(zhǎng)的一段,，也是功能最重要的一段。哺乳動(dòng)物的腸包括小腸,、大腸和直腸3大段,。大量的消化作用和幾乎全部消化產(chǎn)物的吸收都是在小腸內(nèi)進(jìn)行的，大腸主要濃縮食物殘?jiān)?，形成糞便,，再通過(guò)直腸經(jīng)排出體外。腸道堪稱身體最勞累的器官——每天不停地消化,、吸收食物,，以提供足夠的養(yǎng)分，其實(shí)它的功能還遠(yuǎn)不止此——它還是機(jī)體內(nèi)最大的微生態(tài)系統(tǒng),。腸系膜動(dòng)脈由背大動(dòng)脈發(fā)出的走行在腸系膜內(nèi),，分布于消化管的動(dòng)脈。分成腸系膜上動(dòng)脈和腸系膜下動(dòng)脈,。前者主要分布于小腸左側(cè),，后者分布于結(jié)腸,、大腸、泄殖腔等處,。內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮是一薄層的專門(mén)上皮細(xì)胞,，由一層扁平細(xì)胞所組成。它形成血管的內(nèi)壁,，是血管管腔內(nèi)血液及其他血管壁（單層鱗狀上皮）的接口,。內(nèi)皮細(xì)胞是沿著整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)，由心臟直至最小的微血管,。

5.方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的兔腸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞采用-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法,、并通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的兔腸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）,，明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳1-3代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

培養(yǎng)操作：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻,。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘,，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)?/span> 細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中,，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）,。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度,。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。
1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻,。
4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。下面 T25 瓶為類；
1. 細(xì)胞凍存時(shí),，棄去培養(yǎng)基后,，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細(xì)胞變圓 脫 落后,，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化,，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清,。加 1ml 血清重懸細(xì)胞,，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻,，DMSO 終濃度為 10%,，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液,，注意凍 存管做好標(biāo)識(shí),。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱,，2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存,。記錄凍存管位置以便下次拿取。
焦曲霉   阿達(dá)青霉  從望遠(yuǎn)鏡分離,，光學(xué)儀器防霉試驗(yàn)菌

擬康氏木霉   擬青霉  防霉試驗(yàn)菌

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Hydrotaleaflava   醋酸菌

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大鼠抗環(huán)胍氨酸肽抗體(Anti-CCP-antibody)elisa檢測(cè)試劑盒

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人B細(xì)胞κ 輕肽基因增強(qiáng)子核因子抑制因子ε(NFKBIE)elisa分析檢測(cè)試劑盒
實(shí)驗(yàn)報(bào)告：
產(chǎn)品僅用于科研一,、分離與培養(yǎng)：
1、無(wú)菌條件下,，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織,，然后用PBS將此組織塊清洗2次,，最后將成1mm3左右大小,；
2,、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s,，置37℃條件下消化10min,，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清,，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置,；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液,，混懸10s,，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置,，重復(fù)此步驟2-3次,，直至組織*被消化；
4,、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min,，棄去上清,，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶,，放置于37℃ ,，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
5,、差速貼壁1h后,，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng),；
二,、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),，棄去培養(yǎng)基,，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min,，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min,；
2、PBS沖洗細(xì)胞2次,，每次10min,，然后在4℃條件下,，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3,、PBS沖洗細(xì)胞2次,，每次10min，然后在室溫條件下,，用4% BSA封閉細(xì)胞30min,；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗,，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜,；
5、PBS沖洗細(xì)胞3次,，每次10min,，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h,；
6,、用PBS沖洗3次，每次10min,，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照,。