產(chǎn)品屬性：

名稱    大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞
2.組織來源：視網(wǎng)膜組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡介：

大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離自視網(wǎng)膜組織,；視網(wǎng)膜居于眼球壁的內(nèi)層,，是一層透明的薄膜。視網(wǎng)膜由色素上皮層和視網(wǎng)膜感覺層組成,，兩層間在病理情況下可分開,，稱為視網(wǎng)膜脫離。色素上皮層與脈絡(luò)膜緊密相連,，由色素上皮細(xì)胞組成,，它們具有支持和營養(yǎng)光感受器細(xì)胞、遮光,、散熱以及再生和修復(fù)等作用,。組織學(xué)上視網(wǎng)膜分為10層，由外向內(nèi)分別為：色素上皮層,、視錐,、視桿細(xì)胞層、外界膜,、外顆粒層,、外叢狀層、內(nèi)顆粒層,、內(nèi)叢狀層,、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層,、內(nèi)界膜,。視網(wǎng)膜內(nèi)層為襯于血管膜內(nèi)面的一層薄膜，有感光作用,；后部鼻側(cè)有一視神經(jīng)乳頭,。視網(wǎng)膜上的感覺層是由三個(gè)神經(jīng)元組成,。第一神經(jīng)元是視細(xì)胞層，專司感光,，它包括錐細(xì)胞和桿細(xì)胞,。視桿細(xì)胞主要在離中心凹較遠(yuǎn)的視網(wǎng)膜上，而視錐細(xì)胞則在中心凹處多,。第二層叫雙節(jié)細(xì)胞,，約有10到數(shù)百個(gè)視細(xì)胞通過雙節(jié)細(xì)胞與一個(gè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相聯(lián)系，負(fù)責(zé)聯(lián)絡(luò)作用,。第三層叫節(jié)細(xì)胞層,，專管傳導(dǎo)。視網(wǎng)膜是一層菲薄的但又非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu),，它貼于眼球的后壁部,，傳遞來自視網(wǎng)膜感受器沖動的神經(jīng)纖維跨越視網(wǎng)膜表面，經(jīng)由視神經(jīng)到達(dá)出口,。視網(wǎng)膜的分辨力是不均勻的,，在黃斑區(qū)，其分辨能力強(qiáng),。它是組成血管腔面單層扁平上皮樣細(xì)胞,，它所產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)對維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓,、抗血栓形成等有重要作用,，在視網(wǎng)膜血管疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要病理生理學(xué)意義。由于從不同的組織和器官獲得的內(nèi)皮細(xì)胞具有不同的特性,，在腦和視網(wǎng)膜中,，這些內(nèi)皮細(xì)胞具有內(nèi)屏障的功能，在調(diào)節(jié)血管生理狀態(tài),，釋放血管活性物質(zhì)以及新生血管的形成中發(fā)揮著重要作用,，體外分離培養(yǎng)RCEC對研究視網(wǎng)膜血管性疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制以及疾病的早期防治具有重要臨床意義。

5.方法簡介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞采用膠原酶-混合消化法結(jié)合密度梯度離心法,、后通過內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質(zhì)量檢測：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)CD31免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）,，明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存,。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下,， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時(shí),， 以防止冰晶過大,，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,，惟存活率稍微降低一些。
培養(yǎng)操作：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻,。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液,，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?/span> 細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次,。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化,。
3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類,；
1. 細(xì)胞凍存時(shí),，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ,，細(xì)胞變圓 脫 落后,，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清,。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO,，輕輕混勻,，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml,，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液,，注意凍 存管做好標(biāo)識。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中,，放入-80 度冰箱,，2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取,。
實(shí)驗(yàn)報(bào)告：
產(chǎn)品僅用于科研一,、分離與培養(yǎng)：
1、無菌條件下,，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織,，然后用PBS將此組織塊清洗2次，后將成1mm3左右大??；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶）,，混懸10s,，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液,，自然沉淀并收集上清,，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液,，混懸10s,，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置,，重復(fù)此步驟2-3次,，直至組織*被消化；
4,、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液,，1200r/min 離心10min，棄去上清,，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸,，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ,，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；
5、差速貼壁1h后,，吸出培養(yǎng)基,，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；
二,、免疫熒光鑒定：
1,、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基,，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min,，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min,；
2、PBS沖洗細(xì)胞2次,，每次10min,，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min,；
3,、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min,，然后在室溫條件下,，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；
4,、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗,，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；
5、PBS沖洗細(xì)胞3次,，每次10min,，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h,；
6,、用PBS沖洗3次，每次10min,，后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照,。
露濕漆斑菌   長雙歧桿菌

蘇云金芽胞桿菌九州亞種Bacillusthuringiensissubsp.kyushuensis   乳酸鏈球菌

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雞腿蘑(毛頭鬼傘)   束狀刺盤孢

假單胞菌   嗜熱脂肪芽孢桿菌
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