冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存,。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大,，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,，惟存活率稍微降低一些,。

產品屬性：

名稱    大鼠角膜基質細胞
2.組織來源：眼角膜組織

3.產品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

大鼠角膜基質細胞分離自眼角膜組織；角膜位于眼球前壁的一層透明膜,，約占纖維膜的前1/6,，從后面看角膜呈正圓形，從前面看為橫橢圓形,。角膜厚度各部分不盡相同,，中央部薄。角膜有十分敏感的神經末梢,，如有外物接觸角膜,，眼瞼便會不由自主地合上以保護眼睛。為了保持透明,，角膜并沒有血管,，透過外界空氣、淚液及房水獲取養(yǎng)份及氧氣,。角膜分為五層,，由前向后依次為：上皮細胞層、前彈力層,、基質層,、后彈力層、內皮細胞層,。角膜基質層是角膜的主要組成部分,，占據角膜厚度的90%,，由角膜基質細胞,、膠原纖維和細胞外基質構成。角膜基質層缺損的修復主要由角膜基質細胞的增殖及分泌細胞外基質完成,。角膜基質層具有結構規(guī)整,，透明度高的特點，正常情況下角膜基質細胞分泌組成基質層的成分,，維持角膜的透明度,，此細胞對于角膜損傷的修復具有重要意義,。角膜基質細胞，存在于角膜基質層中,，在正常情況下,，處于靜止狀態(tài)。但當角膜損傷時,，不同上皮來源的因子及環(huán)境信號,，將影響角膜基質細胞的應答反應，決定著角膜能否*被修復,。

5.方法簡介：

公司實驗室分離的大鼠角膜基質細胞采用膠原酶消化后組織貼塊法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質量檢測：

公司實驗室分離的大鼠角膜基質細胞經Vimentin免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細菌,、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 梭形、多角形

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

培養(yǎng)操作：
1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻,。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液,，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并 檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次,。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分 變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化,。
3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,，棄去上清液,，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時,，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類,；
1. 細胞凍存時,，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ,，細胞變圓 脫 落后,，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數板計數,。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清,。加 1ml 血清重懸細胞，根據細胞數量加 入血 清和 DMSO,，輕輕混勻,，DMSO 終濃度為 10%，細胞密度不低于1x106/ml,，每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液,，注意凍 存管做好標識。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中,，放入-80 度冰箱,，2 個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取,。
人白細胞分離液 1.078200mL  0.5mL DNA 離心超濾管 (90-150 KD)1個

人中性粒細胞分離液 1.085200mL  0.5mL DNA 離心超濾管 (30-50 KD)1個

人粒細胞分離液 1.113200mL  0.5mL DNA 離心超濾管 (150-250 KD)1個

小鼠腫瘤細胞分離液 1.070200mL 

小鼠內皮細胞分離液 1.071200mL
二胺氧化酶DAO測試盒生化分析儀  25ml / 80T 紫外比色法

線粒體呼吸鏈復合物 Ⅰ 活性測試盒NADH-Q還原酶 20管/10樣 生化法

線粒體呼吸鏈復合物 Ⅱ 活性測試盒琥珀酸-Q還原酶 20管/10樣 生化法

線粒體呼吸鏈復合物 Ⅲ 活性測試盒 20管/10樣 生化法

Q-還原酶 20管/10樣
大鼠角膜基質細胞人生長分化因子9（GDF-9）elisa檢測試劑盒

人生長激素（GH）elisa檢測試劑盒

人生長激素釋放肽（Ghrelin）elisa檢測試劑盒

人（SS）elisa檢測試劑盒

人醇結合蛋白4（RBP4）elisa檢測試劑盒
實驗報告：
產品僅用于科研一,、分離與培養(yǎng)：
1、無菌條件下,，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織,，然后用PBS將此組織塊清洗2次,，后將成1mm3左右大??；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶）,，混懸10s,，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液,，自然沉淀并收集上清,，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
3,、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液,，混懸10s，置37℃消化10 min后,，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置,，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化,；
4,、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min,，棄去上清,，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶,，放置于37℃ ,，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
5,、差速貼壁1h后,，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng),；
二,、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細胞生長至80%融合時,，棄去培養(yǎng)基,，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min,，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min,；
2、PBS沖洗細胞2次,，每次10min,，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3,、PBS沖洗細胞2次,，每次10min，然后在室溫條件下,，用4% BSA封閉細胞30min,；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗,，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜,；
5、PBS沖洗細胞3次,，每次10min,，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h,；
6,、用PBS沖洗3次，每次10min,，后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照,。