阿菲波菌屬通用PCR進(jìn)口試劑盒組成及試劑配制:

1,、酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2,、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為200 U/L,，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L,，100 U/L,，50 U/L，25 U/L,，12.5 U/L,，6.25 U/L,，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L,。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

3,、 樣品稀釋液：1×20ml。

4,、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml,。

5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml,。

反應(yīng)五要素：

衣氏放線菌PCR檢測(cè)試劑盒參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶、dNTP,、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度,。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增,。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右,。

②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),，特別是3'端的互補(bǔ),，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶,。

⑤引物3'端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗,。