1,，試劑準(zhǔn)備
按ELISA試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑,。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測量較正,。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存,。
2,，洗滌
洗滌在ELISA試劑盒過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗,。ELISA試劑盒就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來,。可以說在ELISA操作中,，洗滌是*主要的關(guān)鍵技術(shù),，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌,，不得馬虎,。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種,，過程如下：
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液,；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）,；c.浸泡,，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘,，間歇搖動(dòng),，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體,。吸干應(yīng)*,，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干,；e.重復(fù)操作c和d,，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高,，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時(shí)間,。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法,。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán),，也含親水基團(tuán),，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用,，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體,。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,，其濃度可在0.05%-0.2%之間,，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度,。
（2）流水沖洗式 流水沖洗法*初用于小珠載體的洗滌,，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時(shí)附接一特殊裝置,，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)淋洗,，持續(xù)沖洗2分鐘后，吸干液體,，再用蒸餾水浸泡2分鐘,，吸干即可。浸泡式猶如盆浴,，流水沖洗式則好比淋浴,，其洗滌效果更為*，且也簡便,、快速,。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌,。洗滌時(shí)設(shè)法加大水流量或加大水壓,，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳,。
3,，保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后,?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育（incubation）,，有人稱之為孵育,，在ELISA中似不恰當(dāng)。
ELISA屬固相免疫測定,，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標(biāo)本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有*貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個(gè)逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育,。
溫育常采用的溫度有43℃,、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等,。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。ELISA試劑盒在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí),，實(shí)驗(yàn)表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá),。為加速反應(yīng),，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行,，但不宜采用更高的溫度,。抗原抗體反應(yīng)4℃更為*,，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜,，以形成*多的沉淀。但因所需時(shí)間太長,，在ELISA中一般不予采用,。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴,，可將ELISA板置于水浴箱中,，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡,。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上,。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi),，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底墊濕的紗布，*后將ELISA板放在濕紗布上,。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此,。無論是水浴還是濕盒溫育,，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng),，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi),，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要求控制溫育,。室溫溫育時(shí),，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確,。為保證這一點(diǎn),，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定,。