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★CQ★現(xiàn)象描述:

我昨天早上傳的代,，晚上看還是好好的，培養(yǎng)基顏色正常,，今天早上9點(diǎn)鐘左右,，培養(yǎng)基就變渾濁了，顯微鏡下觀察細(xì)胞好多都已經(jīng)漂起來(lái)了,，明顯是污染了,，但我的培養(yǎng)液里明明加了雙抗了啊,？

這個(gè)問(wèn)題等同于,，

明明有免疫系統(tǒng)的我們

為什么還是感冒了呢

★CQ★解答一

>> 加雙抗只是有一定的預(yù)防作用，但不能避免污染

現(xiàn)在很多細(xì)菌對(duì)雙抗都有耐藥性,，所以加了也不一定就能殺死,；雙抗的保存方式的問(wèn)題,，青霉素在37℃下很快就會(huì)分解掉；污染的細(xì)菌是不是在抗菌譜中,；如果是真菌的話雙抗就沒(méi)有什么卵用的,；

★CQ★解答二

>> 養(yǎng)細(xì)胞要從源頭做起，杜絕各種污染

剛買來(lái)的或借來(lái)的細(xì)胞株,，一般都會(huì)在培養(yǎng)基中添加抗生素,，待通過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不要加抗生素,；

還有就是無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)建議zuihao不加雙抗,，因?yàn)闆](méi)有血清的保護(hù)，細(xì)胞此時(shí)是比較脆弱的,，很容易受到雙抗的毒副作用影響,。

加雙抗并不是*除菌的方法。要防止污染除了使用雙抗,，還要注意污染源大多來(lái)自換液和消化時(shí)的操作不正規(guī),，如果你在處理細(xì)胞得操作過(guò)程不規(guī)范，即便加入雙抗也很難避免污染,。就像抵抗力再?gòu)?qiáng)的漢紙,，如果任由自己在寒風(fēng)中、雨雪天氣里任性,，像一顆海草隨風(fēng)飄搖的話,，終有崩潰的一天。所以保證細(xì)胞處理過(guò)程或培養(yǎng)基配制過(guò)程中的無(wú)菌操作才是關(guān)鍵,。

★CQ★解答三

>> 不是所有的細(xì)胞污染都用相同的解決辦法

很多實(shí)驗(yàn)室在遇到細(xì)胞污染,，準(zhǔn)確的說(shuō)是懷疑細(xì)胞受到污染（原因不明導(dǎo)致的細(xì)胞狀態(tài)不好）時(shí)，都會(huì)選擇一種處理方式——扔掉,！害怕他會(huì)傳染到其他的細(xì)胞,，但是往往你們?nèi)拥舻氖?ldquo;受害者”，而沒(méi)找到“真兇”,。

并不是所有的細(xì)胞污染都能用扔掉解決,，也并不是所有的細(xì)胞污染都可以用同一種試劑解決。

辨別細(xì)胞狀態(tài),，找到根源,，“對(duì)癥下藥”才是關(guān)鍵。

（1）細(xì)菌污染 

狀態(tài)：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,，根據(jù)感染細(xì)菌的不同,，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃,，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯,。 

解決方法： 

1.仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況,，是否在高壓滅菌時(shí)放氣時(shí)間和壓力足夠！尤其是和儲(chǔ)存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品,，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲(chǔ)存液污染,，一定要檢查培養(yǎng)液是否存在渾濁現(xiàn)象！ 

2.可在培養(yǎng)液或血清中加支原體預(yù)防劑,，以及的細(xì)菌清除劑,。 

（2）霉菌及真菌污染 

狀態(tài)：肉眼觀察培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色基本無(wú)變化,，不渾濁,，但是培養(yǎng)基中由絮狀漂浮物，顯微鏡下觀察,，若感染真菌可看到分叉細(xì)絲狀的結(jié)構(gòu)（不同種類結(jié)構(gòu)不同）,，若感染霉菌，顯微鏡下可看到片狀的結(jié)構(gòu),，不透明,，真菌及霉菌對(duì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不大。 

解決方法： 

1.保證細(xì)胞房的干凈整潔,，干燥的環(huán)境(潮濕的環(huán)境利于霉菌及真菌的生長(zhǎng)),。 

2.控制外來(lái)人員進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室。 

3.對(duì)實(shí)驗(yàn)室及培養(yǎng)箱進(jìn)行*消毒,，推薦使用專門針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的抑菌劑,。 

4.若細(xì)胞非常珍貴，且不易獲得,，可以對(duì)污染的細(xì)胞采取如下操作,。 

懸浮細(xì)胞：收集細(xì)胞并離心，用PBS漂洗,，重復(fù)此操作數(shù)次,。貼壁細(xì)胞：用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，重復(fù)此操作數(shù)次,。加入殺滅真菌

（3）支原體感染 

狀態(tài)：顯微鏡下很難捕捉,，培養(yǎng)液一般不會(huì)渾濁,，國(guó)內(nèi)血清很多沒(méi)做支原體陰性檢測(cè),，而支原體是牛血清中zui常見(jiàn)的微生物之一。而且它不能用過(guò)濾的辦法除去,。支原體感染細(xì)胞以后,，細(xì)胞病變不很明顯，只是生長(zhǎng)緩慢,，直至慢慢凋亡,。 

解決方法： 

>>預(yù)防：實(shí)驗(yàn)室新購(gòu)買的血清及培養(yǎng)基需檢測(cè)是否含有支原體,，引進(jìn)的新品種細(xì)胞需做支原體檢測(cè)，向培養(yǎng)基中添加支原體預(yù)防劑,。 

>>補(bǔ)救：將支原體去除劑與*培養(yǎng)液按1:800～1000比例稀釋,，加入細(xì)胞正常培養(yǎng)；并根據(jù)細(xì)胞污染的嚴(yán)重程度,，處理3～6次即可*清除細(xì)胞支原體污染問(wèn)題,。 

（4）黑膠蟲污染 

狀態(tài)：可以穿透濾膜，也可以通過(guò)空氣傳播,，低倍下為黑色點(diǎn)狀,，高倍鏡下可看見(jiàn)黑色的小蟲游來(lái)游去，培養(yǎng)液不渾濁,，一般不會(huì)太影響,，細(xì)胞還可以用。常?？稍谕慌?hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,。

解決方法：

加入黑膠蟲去除劑，改變培養(yǎng)基的品牌,。血清凍融采取逐級(jí)凍融等方法,。

（5）桿菌污染

狀態(tài)：類芽孢桿菌（Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994）呈桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性,、陰性或可變,，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)類芽孢桿菌污染,，會(huì)在顯微鏡下看到一些桿狀游動(dòng)的小蟲子.

解決方法：

a. 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有桿菌污染,，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍,；

b. 然后按1:2000 比例加入類芽孢桿菌去除劑,，即：邊加邊搖勻；

c. 每天處理一次,，類芽孢桿菌去除劑連續(xù)處理3-4天,，即可*清除桿菌污染。

除以上污染源外,，配液消毒問(wèn)題,、操作問(wèn)題也是污染原因之一。關(guān)于培養(yǎng)基的無(wú)菌狀況,，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞）,，37℃試培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察，如果沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)就是操作及細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境的問(wèn)題,。

★CQ★細(xì)胞培養(yǎng),，尤其是細(xì)胞系的培養(yǎng),，就細(xì)胞消化而言，多做,、善于總結(jié),，就可以把細(xì)胞養(yǎng)的越來(lái)越好。

★CQ★絕大部分細(xì)胞消化只要用胰酶潤(rùn)洗一遍即可：

吸去胰酶后,，殘留的那些無(wú)法計(jì)算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細(xì)胞（絕大部分1min不到）,。對(duì)于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代,，對(duì)細(xì)胞傷害很大,。簡(jiǎn)單的程序是PBS潤(rùn)洗吸去，胰酶潤(rùn)洗吸去,，然后37度消化,。

★CQ★什么算是消化好了呢？

不需要把細(xì)胞全部消化成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了,，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層,，只要能移動(dòng)了，多半呈沙壯移動(dòng),，其實(shí)已經(jīng)可以了,。

一般能移動(dòng)了，說(shuō)明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了,，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了,，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了（雖然沒(méi)有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個(gè)時(shí)候應(yīng)該停止消化,，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好,，間隙很大，才停止,。

細(xì)胞就是*成單個(gè)細(xì)胞懸液,，之后在貼壁的過(guò)程中仍然會(huì)聚集，這個(gè)是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特性,，你可以嘗試，準(zhǔn)備100%的單個(gè)細(xì)胞懸液,，貼壁后觀察細(xì)胞,，仍然是幾個(gè)幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起。

一些懸浮培養(yǎng)細(xì)胞也是如此,，容易聚集,，不要過(guò)幾個(gè)小時(shí)就拿出來(lái)吹打成單細(xì)胞懸液,。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來(lái),，即使是成片的（比如Calu-3細(xì)胞）,，吹打不超過(guò)20次（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個(gè)細(xì)胞左右）是正常的,，不要再去延長(zhǎng)消化時(shí)間,，等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)。

★CQ★比較難消化的細(xì)胞：

潤(rùn)洗方法5min還不能消化,，以結(jié)腸癌細(xì)胞為例,，比如HCT15、LS411和KM12細(xì)胞,，胰酶消化,，一般10 cm 培養(yǎng)皿，一次zui多加入300ul-500ul就足夠了,。即使這樣難消化的細(xì)胞,，一般不超過(guò)5min，即可見(jiàn)細(xì)胞成片移動(dòng),，就應(yīng)該停止消化,。一些正常細(xì)胞也會(huì)有難消化的時(shí)候，比如tsDC細(xì)胞,，用胰酶孵育,，3min左右即可看到成片沙狀移動(dòng)。

★CQ★常規(guī)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn),，受消化影響不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用潤(rùn)洗的方法消化的話（難消化細(xì)胞例外）,。但少數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如病毒包裝,，對(duì)細(xì)胞代數(shù),，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)要求*。這個(gè)時(shí)候,，胰酶消化,，就是潤(rùn)洗，都會(huì)對(duì)細(xì)胞包裝病毒的能力有影響,，傳代次數(shù)一多,，細(xì)胞包裝能力就會(huì)逐漸下降。這個(gè)時(shí)候都不用胰酶消化,，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可,。這些鹽溶液通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)酶的活性，來(lái)使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面,，但不切割任何蛋白,。

★CQ★EDTA的作用：

許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA聯(lián)合作用,。這里要明白,，胰酶切割細(xì)胞外基質(zhì)的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA通過(guò)螯合Ca離子,，作用于整聯(lián)蛋白的活性,，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶里添加一些EDTA,，或者對(duì)付特別難消化的細(xì)胞,，添加多一些EDTA，就是這個(gè)道理,。一般不要試圖延長(zhǎng)消化時(shí)間（如果10min還消化不*的話）,，而應(yīng)該想其它辦法。

★CQ★PBS洗滌：

消化之前用PBS洗滌,，是常見(jiàn)的操作,，因?yàn)檠逯泻幸种埔让傅牡鞍住?duì)于一些難消化細(xì)胞,，可以配制不含Ca,，Mg離子的PBS，因?yàn)檫@些離子也會(huì)抑制胰酶的活性,。但對(duì)于絕大部分細(xì)胞用胰酶或者EDTA溶液潤(rùn)洗即可消化,，不需要配制不含Ca，Mg離子的溶液,。

每段時(shí)間定期對(duì)細(xì)胞房,、培養(yǎng)箱&水盤、水浴鍋,、廢液桶等容易染菌的個(gè)角落細(xì)菌,、真菌等微生物的清除，每次操作完都整理好細(xì)胞房,，帶好手套,、口罩、鞋套,，防止人為因素污染,。一旦發(fā)現(xiàn)污染，及時(shí)處理,。

★CQ★細(xì)胞培養(yǎng),，尤其是細(xì)胞系的培養(yǎng)，就細(xì)胞消化而言,，多做,、善于總結(jié),，就可以把細(xì)胞養(yǎng)的越來(lái)越好。

★CQ★絕大部分細(xì)胞消化只要用胰酶潤(rùn)洗一遍即可：

吸去胰酶后,，殘留的那些無(wú)法計(jì)算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細(xì)胞（絕大部分1min不到）,。對(duì)于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代,，對(duì)細(xì)胞傷害很大。簡(jiǎn)單的程序是PBS潤(rùn)洗吸去,，胰酶潤(rùn)洗吸去,，然后37度消化。

★CQ★什么算是消化好了呢,？

不需要把細(xì)胞全部消化成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了,，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動(dòng)了,，多半呈沙壯移動(dòng),，其實(shí)已經(jīng)可以了。

一般能移動(dòng)了,，說(shuō)明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了,，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了（雖然沒(méi)有呈現(xiàn)很廣的離散分布）,。這個(gè)時(shí)候應(yīng)該停止消化,，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大,，才停止,。

細(xì)胞就是*成單個(gè)細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過(guò)程中仍然會(huì)聚集,，這個(gè)是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特性，你可以嘗試,，準(zhǔn)備100%的單個(gè)細(xì)胞懸液,，貼壁后觀察細(xì)胞，仍然是幾個(gè)幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起,。

一些懸浮培養(yǎng)細(xì)胞也是如此,，容易聚集，不要過(guò)幾個(gè)小時(shí)就拿出來(lái)吹打成單細(xì)胞懸液,。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來(lái),，即使是成片的（比如Calu-3細(xì)胞），吹打不超過(guò)20次（一般10次即可）,，成小規(guī)模聚集（10個(gè)細(xì)胞左右）是正常的,，不要再去延長(zhǎng)消化時(shí)間，等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)。

★CQ★比較難消化的細(xì)胞：

潤(rùn)洗方法5min還不能消化,，以結(jié)腸癌細(xì)胞為例,，比如HCT15、LS411和KM12細(xì)胞,，胰酶消化,，一般10 cm 培養(yǎng)皿，一次zui多加入300ul-500ul就足夠了,。即使這樣難消化的細(xì)胞,，一般不超過(guò)5min，即可見(jiàn)細(xì)胞成片移動(dòng),，就應(yīng)該停止消化,。一些正常細(xì)胞也會(huì)有難消化的時(shí)候，比如tsDC細(xì)胞,，用胰酶孵育,，3min左右即可看到成片沙狀移動(dòng)。

★CQ★常規(guī)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn),，受消化影響不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用潤(rùn)洗的方法消化的話（難消化細(xì)胞例外）,。但少數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如病毒包裝,，對(duì)細(xì)胞代數(shù),，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)要求*。這個(gè)時(shí)候,，胰酶消化,，就是潤(rùn)洗，都會(huì)對(duì)細(xì)胞包裝病毒的能力有影響,，傳代次數(shù)一多,，細(xì)胞包裝能力就會(huì)逐漸下降。這個(gè)時(shí)候都不用胰酶消化,，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可,。這些鹽溶液通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)酶的活性，來(lái)使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面,，但不切割任何蛋白,。

★CQ★EDTA的作用：

許多人不用胰酶，只用EDTA,，或者用胰酶/EDTA聯(lián)合作用,。這里要明白，胰酶切割細(xì)胞外基質(zhì)的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白,，而EDTA通過(guò)螯合Ca離子,，作用于整聯(lián)蛋白的活性,，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶里添加一些EDTA,，或者對(duì)付特別難消化的細(xì)胞,，添加多一些EDTA，就是這個(gè)道理,。一般不要試圖延長(zhǎng)消化時(shí)間（如果10min還消化不*的話）,，而應(yīng)該想其它辦法。

★CQ★PBS洗滌：

消化之前用PBS洗滌,，是常見(jiàn)的操作,，因?yàn)檠逯泻幸种埔让傅牡鞍住?duì)于一些難消化細(xì)胞,，可以配制不含Ca,，Mg離子的PBS,，因?yàn)檫@些離子也會(huì)抑制胰酶的活性,。但對(duì)于絕大部分細(xì)胞用胰酶或者EDTA溶液潤(rùn)洗即可消化，不需要配制不含Ca,，Mg離子的溶液,。

每段時(shí)間定期對(duì)細(xì)胞房、培養(yǎng)箱&水盤,、水浴鍋,、廢液桶等容易染菌的個(gè)角落細(xì)菌、真菌等微生物的清除,，每次操作完都整理好細(xì)胞房,，帶好手套、口罩,、鞋套,，防止人為因素污染。一旦發(fā)現(xiàn)污染,，及時(shí)處理,。

★CQ★解答一

>> 加雙抗只是有一定的預(yù)防作用，但不能避免污染

現(xiàn)在很多細(xì)菌對(duì)雙抗都有耐藥性,，所以加了也不一定就能殺死,；雙抗的保存方式的問(wèn)題，青霉素在37℃下很快就會(huì)分解掉,；污染的細(xì)菌是不是在抗菌譜中,；如果是真菌的話雙抗就沒(méi)有什么卵用的；

★CQ★解答二

>> 養(yǎng)細(xì)胞要從源頭做起,，杜絕各種污染

剛買來(lái)的或借來(lái)的細(xì)胞株,，一般都會(huì)在培養(yǎng)基中添加抗生素,，待通過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不要加抗生素,；

還有就是無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)建議zuihao不加雙抗,，因?yàn)闆](méi)有血清的保護(hù)，細(xì)胞此時(shí)是比較脆弱的,，很容易受到雙抗的毒副作用影響,。

加雙抗并不是*除菌的方法。要防止污染除了使用雙抗,，還要注意污染源大多來(lái)自換液和消化時(shí)的操作不正規(guī),，如果你在處理細(xì)胞得操作過(guò)程不規(guī)范，即便加入雙抗也很難避免污染,。就像抵抗力再?gòu)?qiáng)的漢紙,，如果任由自己在寒風(fēng)中、雨雪天氣里任性,，像一顆海草隨風(fēng)飄搖的話,，終有崩潰的一天。所以保證細(xì)胞處理過(guò)程或培養(yǎng)基配制過(guò)程中的無(wú)菌操作才是關(guān)鍵,。

★CQ★解答三

>> 不是所有的細(xì)胞污染都用相同的解決辦法

很多實(shí)驗(yàn)室在遇到細(xì)胞污染,，準(zhǔn)確的說(shuō)是懷疑細(xì)胞受到污染（原因不明導(dǎo)致的細(xì)胞狀態(tài)不好）時(shí)，都會(huì)選擇一種處理方式——扔掉,！害怕他會(huì)傳染到其他的細(xì)胞,，但是往往你們?nèi)拥舻氖?ldquo;受害者”，而沒(méi)找到“真兇”,。

并不是所有的細(xì)胞污染都能用扔掉解決,，也并不是所有的細(xì)胞污染都可以用同一種試劑解決。

辨別細(xì)胞狀態(tài),，找到根源,，“對(duì)癥下藥”才是關(guān)鍵。

（1）細(xì)菌污染 

狀態(tài)：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,，根據(jù)感染細(xì)菌的不同,，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃,，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯,。 

解決方法： 

1.仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時(shí)放氣時(shí)間和壓力足夠,！尤其是和儲(chǔ)存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品,，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲(chǔ)存液污染，一定要檢查培養(yǎng)液是否存在渾濁現(xiàn)象,！ 

2.可在培養(yǎng)液或血清中加支原體預(yù)防劑,，以及的細(xì)菌清除劑,。 

（2）霉菌及真菌污染 

狀態(tài)：肉眼觀察培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色基本無(wú)變化,，不渾濁,，但是培養(yǎng)基中由絮狀漂浮物，顯微鏡下觀察,，若感染真菌可看到分叉細(xì)絲狀的結(jié)構(gòu)（不同種類結(jié)構(gòu)不同）,，若感染霉菌，顯微鏡下可看到片狀的結(jié)構(gòu),，不透明,，真菌及霉菌對(duì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不大。 

解決方法： 

1.保證細(xì)胞房的干凈整潔,，干燥的環(huán)境(潮濕的環(huán)境利于霉菌及真菌的生長(zhǎng)),。 

2.控制外來(lái)人員進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室。 

3.對(duì)實(shí)驗(yàn)室及培養(yǎng)箱進(jìn)行*消毒,，推薦使用專門針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的抑菌劑,。 

4.若細(xì)胞非常珍貴，且不易獲得,，可以對(duì)污染的細(xì)胞采取如下操作,。 

懸浮細(xì)胞：收集細(xì)胞并離心,，用PBS漂洗,，重復(fù)此操作數(shù)次。貼壁細(xì)胞：用PBS輕輕沖洗細(xì)胞,，重復(fù)此操作數(shù)次,。加入殺滅真菌

（3）支原體感染 

狀態(tài)：顯微鏡下很難捕捉，培養(yǎng)液一般不會(huì)渾濁,，國(guó)內(nèi)血清很多沒(méi)做支原體陰性檢測(cè),，而支原體是牛血清中zui常見(jiàn)的微生物之一。而且它不能用過(guò)濾的辦法除去,。支原體感染細(xì)胞以后,，細(xì)胞病變不很明顯，只是生長(zhǎng)緩慢,，直至慢慢凋亡,。 

解決方法： 

>>預(yù)防：實(shí)驗(yàn)室新購(gòu)買的血清及培養(yǎng)基需檢測(cè)是否含有支原體，引進(jìn)的新品種細(xì)胞需做支原體檢測(cè),，向培養(yǎng)基中添加支原體預(yù)防劑,。 

>>補(bǔ)救：將支原體去除劑與*培養(yǎng)液按1:800～1000比例稀釋，加入細(xì)胞正常培養(yǎng),；并根據(jù)細(xì)胞污染的嚴(yán)重程度,，處理3～6次即可*清除細(xì)胞支原體污染問(wèn)題,。 

（4）黑膠蟲污染 

狀態(tài)：可以穿透濾膜，也可以通過(guò)空氣傳播,，低倍下為黑色點(diǎn)狀,，高倍鏡下可看見(jiàn)黑色的小蟲游來(lái)游去,，培養(yǎng)液不渾濁,，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還可以用,。常?？稍谕慌?hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,。

解決方法：

加入黑膠蟲去除劑，改變培養(yǎng)基的品牌,。血清凍融采取逐級(jí)凍融等方法,。

（5）桿菌污染

狀態(tài)：類芽孢桿菌（Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994）呈桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性,、陰性或可變,，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)類芽孢桿菌污染,，會(huì)在顯微鏡下看到一些桿狀游動(dòng)的小蟲子.

解決方法：

a. 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有桿菌污染,，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍,；

b. 然后按1:2000 比例加入類芽孢桿菌去除劑,，即：邊加邊搖勻；

c. 每天處理一次,，類芽孢桿菌去除劑連續(xù)處理3-4天,，即可*清除桿菌污染。

除以上污染源外,，配液消毒問(wèn)題,、操作問(wèn)題也是污染原因之一。關(guān)于培養(yǎng)基的無(wú)菌狀況,，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞）,，37℃試培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察，如果沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)就是操作及細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境的問(wèn)題,。 

★CQ★TIPs：細(xì)胞操作及細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境問(wèn)題如何解決,？ 

1、提高細(xì)胞操作技巧,，禁止交叉使用槍頭,，在酒精燈火焰5公分距離內(nèi)操作。 

2,、定期對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)箱消毒,，培養(yǎng)箱水盤中的水也要定期更換,，并使用無(wú)菌水。 

3,、進(jìn)入細(xì)胞房之前及在無(wú)菌操作臺(tái)操作細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前需使用紫外燈照射30min,。定期使用細(xì)胞房除菌劑對(duì)細(xì)胞房空間進(jìn)行處理。

4,、每次開(kāi)培養(yǎng)箱之前需用酒精消毒雙手,。 

5、用培養(yǎng)箱除菌劑和水盤抑菌劑定期對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒,。 

6,、配制的培養(yǎng)基需驗(yàn)證無(wú)菌后方可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。