細(xì)胞名稱：

• 公司建立有標(biāo)準(zhǔn)化GMP細(xì)胞培養(yǎng)車間,，依托引進(jìn)ATCC,、DSMZ、ECACC,、RIKEN,、中科院、協(xié)和醫(yī)院引進(jìn)保藏細(xì)胞種類近四千株,，從來源，引進(jìn),，培養(yǎng),，凍存，復(fù)蘇,，運輸,，注重每一個環(huán)節(jié)，提供活力強(qiáng),，代數(shù)靠前,，優(yōu)質(zhì)細(xì)胞株細(xì)胞系。

傳代操作：

1.吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液,。

2.加入無菌pbs洗液（5-8mL）輕輕潤濕細(xì)胞,，稀釋多余的培養(yǎng)基，之后吸走洗液,，動作要輕,，不可吹打到細(xì)胞。

3.向瓶內(nèi)加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許,，以能覆滿瓶底為限,。

4.置溫箱中2~5分鐘，一旦鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮,，細(xì)胞間隙增大后,，細(xì)胞變圓，比較松動后,，立即終止消化,。

5.加入該細(xì)胞對應(yīng)的培養(yǎng)基6mL（T25培養(yǎng)瓶）或12mL（T75培養(yǎng)瓶）終止消化。

6.用吸管通過吸取的培養(yǎng)基輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液,。吹打時應(yīng)盡量以zui少的次數(shù)將細(xì)胞從壁上吹下，不僅要控制吹打的力度,、次數(shù),，還要注意要將細(xì)胞盡可能吹成單個。這樣既能減少死細(xì)胞,，又能便于細(xì)胞再次均勻貼壁生長,。

7.依據(jù)傳代比例,，將細(xì)胞懸液分瓶，再補(bǔ)充培養(yǎng)基后,，靜置于溫箱培養(yǎng),，直止貼壁。

貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,，繼續(xù)生長的空間不足,，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積,，需要分瓶培養(yǎng),，對細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增。對于貼壁不太緊的細(xì)胞如293,，可以直接吹散后分瓶,。而對于貼壁較緊的細(xì)胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶,。以筆者的經(jīng)驗,，以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好，但對于經(jīng)驗不太充分的實驗者而言是較難判斷掌握的,。

胰酶消化的程度是一個關(guān)鍵：消化過度則對細(xì)胞的活性影響較大,，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下,，反復(fù)吹打同樣也會損傷細(xì)胞活性,。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性(配制條件,、凍存或4℃保存時間長短,、是否反復(fù)凍融、解凍后存放時間及溫度等),、消化時的溫度(氣溫,、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶會比不含的消化能力強(qiáng)很多,，不同細(xì)胞對消化液的敏感性也不同,，比如HEP-G2人肝癌細(xì)胞，該細(xì)胞消化時間可長達(dá)10分鐘左右,。 消化時間仔細(xì)去摸索一下,，每過2分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄*消化時間,，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可,。

對于懸浮細(xì)胞換液時只需要補(bǔ)液就行。

懸浮細(xì)胞的傳代則不需要用胰酶消化,，直接通過計數(shù)算好傳代的比例,，直接分瓶,，補(bǔ)液。有些懸浮細(xì)胞趨于成團(tuán)生長,，此時細(xì)胞生長狀態(tài)良好,，當(dāng)補(bǔ)液時，避免吹打,。典型實例：jurkat就是成團(tuán)生長,。當(dāng)jurkat細(xì)胞密度比較大時，可將培養(yǎng)瓶豎直放置2分鐘左右,，待大部分細(xì)胞沉下,，吸走上層清液，補(bǔ)充等量的新鮮培養(yǎng)基,。

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