1.吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液,。

       2.加入無菌pbs洗液（5-8mL）輕輕潤(rùn)濕細(xì)胞,，稀釋多余的培養(yǎng)基,，之后吸走洗液,，動(dòng)作要輕,，不可吹打到細(xì)胞,。

       3.向瓶?jī)?nèi)加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許,，以能覆滿瓶底為限。

       4.置溫箱中2~5分鐘,，一旦鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮,，細(xì)胞間隙增大后，細(xì)胞變圓,，比較松動(dòng)后,，立即終止消化。

       5.加入該細(xì)胞對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基6mL（T25培養(yǎng)瓶）或12mL（T75培養(yǎng)瓶）終止消化,。

       6.用吸管通過吸取的培養(yǎng)基輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)應(yīng)盡量以zui少的次數(shù)將細(xì)胞從壁上吹下,，不僅要控制吹打的力度,、次數(shù)，還要注意要將細(xì)胞盡可能吹成單個(gè),。這樣既能減少死細(xì)胞,，又能便于細(xì)胞再次均勻貼壁生長(zhǎng)。

       7.依據(jù)傳代比例,，將細(xì)胞懸液分瓶,，再補(bǔ)充培養(yǎng)基后，靜置于溫箱培養(yǎng),，直止貼壁,。

        貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后,，繼續(xù)生長(zhǎng)的空間不足，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成份也消耗較多,，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積,，需要分瓶培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增,。對(duì)于貼壁不太緊的細(xì)胞如293,，可以直接吹散后分瓶。而對(duì)于貼壁較緊的細(xì)胞如CHO,，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶,。以筆者的經(jīng)驗(yàn)，以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好,，但對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不太充分的實(shí)驗(yàn)者而言是較難判斷掌握的,。

        胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵：消化過度則對(duì)細(xì)胞的活性影響較大，并有部分細(xì)胞漂浮,，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下,，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。影響消化速度的因素較多,，主要有胰酶溶液的活性(配制條件,、凍存或4℃保存時(shí)間長(zhǎng)短、是否反復(fù)凍融,、解凍后存放時(shí)間及溫度等),、消化時(shí)的溫度(氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等,。含有EDTA的胰酶會(huì)比不含的消化能力強(qiáng)很多,，不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性也不同，比如HEP-G2人肝癌細(xì)胞,，該細(xì)胞消化時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)10分鐘左右,。 消化時(shí)間仔細(xì)去摸索一下，每過2分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓,，記錄*消化時(shí)間,，下一次操作參考之前的記錄來控制時(shí)間即可。

        對(duì)于懸浮細(xì)胞換液時(shí)只需要補(bǔ)液就行,。

        懸浮細(xì)胞的傳代則不需要用胰酶消化,，直接通過計(jì)數(shù)算好傳代的比例，直接分瓶,，補(bǔ)液,。有些懸浮細(xì)胞趨于成團(tuán)生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,，當(dāng)補(bǔ)液時(shí),，避免吹打,。典型實(shí)例：jurkat就是成團(tuán)生長(zhǎng)。當(dāng)jurkat細(xì)胞密度比較大時(shí),，可將培養(yǎng)瓶豎直放置2分鐘左右,，待大部分細(xì)胞沉下，吸走上層清液,，補(bǔ)充等量的新鮮培養(yǎng)基,。而HL-60就不一樣了，為懸浮單個(gè)生長(zhǎng),，如果發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞包團(tuán),，說明細(xì)胞狀態(tài)不好，不加以正確的處理,，zui終會(huì)發(fā)生凋亡
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