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牛血清白蛋白(BSA)是牛血清中的一種球蛋白,,包含607個氨基酸殘基,,分子量為66.446KDa,等電點為4.7,。
應(yīng)用: 牛血清白蛋白(BSA)在生化實驗中有廣泛的應(yīng)用,,例如在WB實驗中加入BSA,通過提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度,,對酶起保護(hù)作用,。 防止酶的分解和非特異性吸附,能減輕有些酶的變性減輕不利環(huán)境因素,,如加熱,、表面張力及化學(xué)因素引起的變性。
測定蛋白濃度 按50:1配置BCA工作液,。 10ulC液(蛋白標(biāo)準(zhǔn))+90ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液,。 再分別以0,、1、2,、4,、8、12,、16,、20ul將蛋白標(biāo)準(zhǔn)液加入96孔板的第1~8標(biāo)準(zhǔn)孔中,在其他樣品孔中加入10ul待測樣品,。 分別加PBS定容至20ul,。 各孔中加入200ulBCA工作液,室溫放置2小時,。 用酶標(biāo)儀測定蛋白濃度:測定A562,,依標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蛋白濃度。
SDS-PAGE電泳
1,、制膠:按比例配制分離膠,,緩緩地?fù)u動溶液,使激活劑混合均勻,,將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中,,再在液面上小心注入一層水,以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中,,靜置40min,。 同前按比例配制濃縮膠,但混勻溶液時不要過于劇烈以免引入過多地氧氣,。 吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分,,連續(xù)平穩(wěn)的注入凝膠溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡,,靜制60min以上以保證聚合,。
2、預(yù)電泳:將聚合好的凝膠安置于電泳槽中,,小心拔去梳子,,加入電泳緩沖液后低電壓10-20V的預(yù)電泳20-30min。 (目的是清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì),, 疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通)。
3,、樣品準(zhǔn)備:首先計算上樣體積,,然后按樣品上樣buffer=4:1的比例加入上樣bufer混勻,沸水10分鐘,,冰上5分鐘,。
4,、加樣:預(yù)電泳后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品(Marker)和待分析樣品。 (加樣時間要盡量短,,以免樣品擴散,,可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應(yīng)。每個泳道加5ul ,。)
5,、電泳:加樣完畢,選擇80V恒壓進(jìn)行電泳,,電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿到達(dá)兩膠交界處(一般約20分鐘),,更換至100V恒壓電泳,電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端處,,即停止電泳(一般約為1小時20分鐘),。
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