1.細(xì)胞生長的營養(yǎng)來源

不同的細(xì)胞的培養(yǎng)基是不相同的,，對(duì)于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞來說,，營養(yǎng)配方一般為：90%合成培養(yǎng)基（DMEM、RPMI1640,、MEM等）和10%胎牛血清(FBS),；為了防止污染,，可以適時(shí)加1%雙抗，抗生素的使用應(yīng)為短期,。

Q：細(xì)胞培養(yǎng)基配方如何選擇,？

A: 一般購買細(xì)胞時(shí)，針對(duì)不同的細(xì)胞株,，會(huì)有詳細(xì)的介紹,，包括生長的狀態(tài)圖,、培養(yǎng)基的類型等,。如人源肺癌細(xì)胞A549可用DMEM培養(yǎng)基，在胎牛血清的選擇上也可以選用品牌,、來源可靠的胎牛血清,，能提供較好的營養(yǎng)成分，以滿足細(xì)胞株生長的需要,。

Q：如果細(xì)胞生長緩慢,，需要增加血清比例嗎？

A：可以,。

2.細(xì)胞生長的環(huán)境

舒適無菌的環(huán)境是細(xì)胞健康生活的重要基礎(chǔ),。需要合適的器皿，不同形狀,、規(guī)格,、用途多樣的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等,，最終進(jìn)入合適的恒溫箱培養(yǎng),，如腫瘤細(xì)胞就需37℃，5%CO2的恒溫箱中生長,。

Q：細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶如何選擇,？

A：根據(jù)不同的應(yīng)用選擇不同的培養(yǎng)皿或容量板，如MTS用96孔板,，細(xì)胞爬片用24孔,，流式分析用6空等

而選擇培養(yǎng)皿還是選擇培養(yǎng)瓶，就細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)來說差別不大,，主要是培養(yǎng)瓶的安全系數(shù)更高一些,，數(shù)量也會(huì)大一些，但是成本也相對(duì)較高,，因此沒有特殊要求時(shí),，一般用培養(yǎng)皿即可。

Q：血清是否要滅活處理,，保證環(huán)境無菌,？

A：這取決于您的應(yīng)用。

滅活過程中，會(huì)導(dǎo)致血清中某些成分被破壞,，如氨基酸,，維生素，生長因子等,。所以只有在您的實(shí)驗(yàn)對(duì)血清有特殊要求時(shí),，才會(huì)考慮對(duì)血清進(jìn)行滅活處理。如您的實(shí)驗(yàn)對(duì)血清中的某種組分敏感,，需要去除該組分,。最常見的情況是需要去除血清中的補(bǔ)體蛋白，因?yàn)檠a(bǔ)體在機(jī)體中參與細(xì)胞殺傷,，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化,，肥大細(xì)胞和血小板組胺釋放，平滑肌收縮等過程,，所以一般在免疫學(xué)相關(guān)研究中及肌細(xì)胞和干細(xì)胞的培養(yǎng)過程中需要對(duì)血清進(jìn)行滅活處理,。

3.細(xì)胞復(fù)蘇與凍存

細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存的細(xì)胞解凍之后再重新培養(yǎng)，細(xì)胞從冷凍停止生長狀態(tài)恢復(fù)生長的過程,。

Q：細(xì)胞復(fù)蘇后,，為什么很多難以貼壁？

A：忽略培養(yǎng)基的問題,，主要考慮細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)差或者復(fù)蘇時(shí)動(dòng)作太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡,。切記最重要的融化速度要快，可不時(shí)搖動(dòng)冷凍管,，使之盡快通過最易受損的溫度段（-5～0℃）,。

細(xì)胞凍存則是將細(xì)胞放在低溫（-70℃~196℃）環(huán)境，降低細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng),，最/大限度的保存細(xì)胞活力,，以便長期存儲(chǔ)。

Q：目前細(xì)胞凍存液多采用的什么配方,？

A：目前細(xì)胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑,，細(xì)胞凍存液的配方有很多種，如培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1,，或直接用血清：DMSO=9:1,，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，復(fù)蘇存活率在80%～90%以上,。

4.細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖,，培養(yǎng)皿空間有限，細(xì)胞過密生長就會(huì)受到抑制,，影響細(xì)胞的狀態(tài),，因此我們要把細(xì)胞中的一部分分到別的培養(yǎng)皿里,，這樣細(xì)胞才能生長的好。

Q：細(xì)胞傳代培養(yǎng)為什么要選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞,？

A: 細(xì)胞的生長和分裂,，一般遵循以下模式：停滯期，對(duì)數(shù)期（指數(shù)期）,，平穩(wěn)期（平臺(tái)期）和衰退期,。為了確保活力,，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定,，必須使細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)期。一般細(xì)胞長到70%~80%左右就可以傳代了,。

除了上述幾個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)節(jié)問題外,，細(xì)胞培養(yǎng)還有很多小問題如下：

Q：培養(yǎng)基多久換一次,？

A: 正常情況下,，培養(yǎng)液偏紅色。如果細(xì)胞維持在pH6.5～6.6條件下,，培養(yǎng)基變黃,，說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細(xì)胞會(huì)脫落死亡,，需要更換新鮮培養(yǎng)液,。一般細(xì)胞生長旺盛時(shí)1～2天換一次，生長緩慢時(shí),，3～4天亦可,。針對(duì)復(fù)蘇后的細(xì)胞，建議隔天換液,。

Q：血清應(yīng)如何融解,？

A：從冰箱中取出血清，放于2-8℃融化,，融化過程中不時(shí)旋轉(zhuǎn)（swirling mix）混勻,。充分融解后分裝或平衡到室溫后使用。

Q：如果細(xì)胞形態(tài)不清晰或有異物等,，如何處理,？

A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基,，用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次,，再開始正式的消化、吹打,。其次,，把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),。后續(xù)再密切觀察。

Q：血清中出現(xiàn)絮狀沉淀是否需要去除,？如何去除,？

A：多種原因可能導(dǎo)致絮狀沉淀的形成，最常見的原因之一是融化過程中,，脂蛋白聚集所致,。該現(xiàn)象一般不會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量?？梢?00g離心5分鐘,，取上清，然后過濾,。根據(jù)需要選擇合適的濾膜孔徑,，一般常用的是0.22um PES材質(zhì)的濾膜。為避免濾膜阻塞,，建議離心后取上清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾而不是直接過濾血清,。

總之，細(xì)胞培養(yǎng)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基石,，留心各種細(xì)節(jié)問題,，嚴(yán)守滅菌處理的程序，保護(hù)好自己養(yǎng)的細(xì)胞,，這樣才能快樂地進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn),。