必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃,，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化,，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶,，對細(xì)胞造成損害,。

細(xì)胞復(fù)蘇步驟

一.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
將水浴鍋預(yù)熱至37℃,。
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒,，用75％酒精擦拭并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面。
在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管,、吸管,、培養(yǎng)瓶等。

二．取出凍存管：
根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號,。
從液氮罐中取出細(xì)胞盒,，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對管外的編號,。

三．迅速解凍：
迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍,，并要不斷地?fù)u動，使管中的液體迅速融化,。
約1-2min后凍存管內(nèi)液體*溶解,，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi),。

四.平衡離心：
用架盤天平平衡后,，放入離心機(jī)中1000r/min，離心5min,。

五.制備細(xì)胞懸液：
吸棄上清液,。
向離心管內(nèi)加入10ml預(yù)熱的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液,。
用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞,，調(diào)整細(xì)胞濃度，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

六.細(xì)胞計(jì)數(shù)：
細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜,。

七.培養(yǎng)細(xì)胞：
將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃,，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng),，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。

八. 記錄復(fù)蘇日期：
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)里面容易出問題的部分,，因此必須注意以下幾點(diǎn)~

注意無菌操作,。
取細(xì)胞的過程中可能會接觸液氮，一定注意帶好防凍手套,，護(hù)目鏡,。
此項(xiàng)尤為重要,，如果凍存管密封不嚴(yán)，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮,，解凍時(shí)，在水浴中搖晃,，凍存管中的氣溫急劇上升,，可導(dǎo)致爆炸，所以,，一定要戴保護(hù)眼鏡和手套,，復(fù)蘇過程中應(yīng)蓋上恒溫水浴鍋的蓋。
應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液*融化,。如果復(fù)溫速度太慢,，則會造成細(xì)胞損傷。另外,，細(xì)胞復(fù)蘇后的操作Hao在4℃冰浴中進(jìn)行,，以減少冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的毒性。
復(fù)蘇過程中,，升溫的速率要大,，把從液氮取出的細(xì)胞在短的時(shí)間內(nèi)放入水浴鍋。
離心前須加入少量培養(yǎng)液,。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細(xì)胞的損傷,。

細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml－15ml培養(yǎng)液,，經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附,。
復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：復(fù)蘇1管細(xì)胞一般根據(jù)情況可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中,，分裝過多，細(xì)胞濃度過低,，不利于細(xì)胞的貼壁,。
加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果加培養(yǎng)基的太少,，DMSO的濃度就會比較大,，就會影響細(xì)胞生長，從以前的資料來看,，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響,。還有一個說法是1％。所以如果凍存液的濃度是10％DMSO,，那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度,。

初學(xué)者易犯的錯誤：
水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃直接融化。
水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳,，使融化時(shí)間延長,。
離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失,。
一次復(fù)蘇細(xì)胞種類過多,，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染,。
解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清,。因?yàn)槊恳环N細(xì)胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長環(huán)境,。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清,，會造成細(xì)胞生長不良，甚至死亡,，像水土不服一樣,。

結(jié)果分析：
判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細(xì)胞,，用臺盼藍(lán)染色法檢測復(fù)蘇細(xì)胞的存活率,。呈藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞不著色,。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞,，得出細(xì)胞存活率）。如果復(fù)蘇后95%以上的細(xì)胞貼壁,，而且細(xì)胞的活性好,，這就說明細(xì)胞復(fù)蘇的過程沒有問題。復(fù)蘇的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長,，達(dá)到正常的生長特性（比如細(xì)胞群體倍增時(shí)間等）后要再凍存以補(bǔ)充細(xì)胞儲存數(shù)量,。