HUVEC-人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 

★CQ★實驗材料-新生兒臍帶

試劑： PBS,、膠原酶,、M199培養(yǎng)基、胰酶,、EDTA、DMEM培養(yǎng)基,。

儀器,、耗材：針頭,、手術(shù)鉗、離心管,、低溫離心機,、彎管、明膠,、恒溫培養(yǎng)箱,、顯微鏡。

★CQ★步驟：

1.將 15-20cm 長的新生兒臍帶放入無菌的 PBS 溶液中儲存,。（注：4℃下多貯存 24 小時,，室溫下不超過 6 小時，否則廢棄）

2. 用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中,，用無菌的 PBS 溶液沖洗 3-5 次,，將污血沖洗干凈為止。

3. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端,，加入 15ml 的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化 15-20分鐘,，并不時上下?lián)u動臍帶。

4. 消化完后,，將下端手術(shù)鉗松開,，消化液流入一個 50 ml 無菌離心管中,，用無菌的 PBS 溶液沖洗臍帶 2-3 次,。

5. 將收集液離心（2000 轉(zhuǎn)/ 分）3 分鐘,。

6. 倒去上清，加入 10ml M199 培養(yǎng)基（加入 10U/ml 的 bFGF） ,，用彎管吹散細(xì) 胞,，將所有液體轉(zhuǎn)入一個用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng),。（注：每個培養(yǎng)瓶中加入 3- 4ml 無菌的 1%的明膠溶液,，搖勻使得明膠溶液* 鋪滿瓶底，放入 37℃孵育,，少 2 小時,，用前將明膠溶液倒了即可，明膠包被 有利于細(xì)胞貼壁,。 ）

7. 培養(yǎng) 24 小時后,，倒掉培養(yǎng)基，并用無菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次,，洗掉紅細(xì) 胞和死細(xì)胞,，加入 10 ml 新鮮的 M199 培養(yǎng)基。

8. 以后每 2 天換一次培養(yǎng)基（每次換掉 2/3 的培養(yǎng)基） ,。

9. 一般培養(yǎng) 5-7 天,，細(xì)胞可長滿至 80-90%單層，這時可以傳代,。

10. 倒掉培養(yǎng)基,，用無菌的PBS 溶液清洗 2-3 次,，加入2- 3ml 消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察,，一旦細(xì)胞變圓,，即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

11. 用彎管將細(xì)胞吹打下來,，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個 50 ml 無菌離心管中,，2000 轉(zhuǎn)/分，離心 3 分鐘,。

12. 倒掉上清,，加入 10ml新鮮培基，一般一瓶細(xì)胞可傳代 3-4 瓶,，以后照此傳代培養(yǎng),。

13. 一般傳代 2-3 代（培養(yǎng)了 20 天左右）用于做各種實驗效果zui佳。