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養(yǎng)細(xì)胞是一件戳心戳肺的事情,，你要像照顧小孩一樣仔細(xì)對待，愛護她,，呵護她,。

細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備

在您帶上手套開始細(xì)胞培養(yǎng)之前,先檢查一下移液管和瓶子的數(shù)量是否充足,以免在開始實驗后再次出入操作臺，這樣可以降低細(xì)胞污染的風(fēng)險,。

細(xì)胞培養(yǎng)基也應(yīng)先預(yù)熱,選擇只預(yù)熱部分培養(yǎng)基而非整瓶加熱,不但可以節(jié)約實驗時間,而且可以避免因反復(fù)加熱培養(yǎng)基而造成的蛋白質(zhì)降解,。

結(jié)束操作后,別忘了培養(yǎng)基對光敏感,應(yīng)盡可能避光保存。

細(xì)胞培養(yǎng)的定期檢查,，定期檢查培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài),，即形狀和外觀，對于細(xì)胞培養(yǎng)實驗取得成功至關(guān)重要,。

除確認(rèn)細(xì)胞的健康狀態(tài)外,，每次操作細(xì)胞時通過肉眼和顯微鏡檢查細(xì)胞還可早期發(fā)現(xiàn)污染征象，避免污染擴散至實驗室其他細(xì)胞,。

細(xì)胞變質(zhì)的征象包括核周出現(xiàn)顆粒,、細(xì)胞與基質(zhì)解離以及細(xì)胞質(zhì)空泡形成。

這些變質(zhì)征象可能為多種原因所致，例如：培養(yǎng)物污染,、細(xì)胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質(zhì),，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。

ATCC原代細(xì)胞和菌株代理

一,、傳代培養(yǎng)（消化法）

1,、預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱,。

2,、用75％酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手，嚴(yán)格進行無菌操作前的準(zhǔn)備工作,。

3,、正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染,。

4,、點燃酒精燈：注意火焰適宜。

5,、取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液,，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。

6,、從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時要旋緊瓶蓋,，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細(xì)胞,。

7,、打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒,。

注意事項：嚴(yán)格的無菌操作過程

二,、胰蛋白酶消化

1、加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液,，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液）,，注意消化液的量以蓋住細(xì)胞zui好,，zui佳消化溫度是37℃。

2,、顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞,，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片,，表明此時細(xì)胞消化適度,。

3、吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液,，注意更換吸管,，加入新鮮的培養(yǎng)液,。

注意事項：

適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間,、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響,，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮,，連接變松散,，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

三,、吹打分散細(xì)胞

1,、吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。

2,、吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中,。

3、平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中,，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘,。

4、棄上清液,，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液,，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,。

四,、分裝稀釋細(xì)胞

1、分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中,，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋,。

2、顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量,，必要是計數(shù),。注意密度過小會影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×10^5/ml,。zui后要做好標(biāo)記,。

五、繼續(xù)培養(yǎng)

用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶,，適當(dāng)旋松瓶蓋,，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時后開始貼附在瓶壁上,。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時為一個＋,，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋

細(xì)胞復(fù)蘇-ATCC原代細(xì)胞和菌株代理，ATCC代理

一,、準(zhǔn)備工作

1,、將水浴鍋預(yù)熱至37℃

2、用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面,。

3,、在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管,、培養(yǎng)瓶等等,。

二、取出凍存管

1,、根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號,。

2、從液氮罐中取出細(xì)胞盒,，取出所需的細(xì)胞,，同時核對管外的編號。

三,、迅速解凍

1,、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動,，使管中的液體迅速融化,。

2、約1-2min后凍存管內(nèi)液體*溶解,，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,，再拿入超凈臺內(nèi)。

四,、制備細(xì)胞重懸液

1,、離心（3000rpm,3min)后吸棄上清液。

2,、向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液,，吹打制成細(xì)胞懸液。

五,、細(xì)胞計數(shù)

細(xì)胞濃度以5×10⁵/ml為宜,。

六、細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi),，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)，換液的時間由細(xì)胞情況而定,。

細(xì)胞計數(shù)-ATCC原代細(xì)胞和菌株代理,，ATCC代理

 當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目,。

一,、準(zhǔn)備工作

取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞,，待長成單層后以被使用,。

二、細(xì)胞懸液制備細(xì)胞懸液制備

細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化,、PBS液洗滌后,，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細(xì)胞懸液,。

三,、細(xì)胞計數(shù)

1、蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板,，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上,。

2、制備計數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中,，加入5滴臺盼藍染液（0.4％）或苯胺黑,，活細(xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞,。

3,、將細(xì)胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入,，要保證蓋片下充滿懸液,，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中,。

4,、統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板,，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后,，數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。

5,、計算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計算細(xì)胞密度：

（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝ （ 四個大格子細(xì)胞數(shù)/4) ×2×104

說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù),。

公式中乘以2因為細(xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。

公式中乘以10^4因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm³ 而 1ml＝1000mm³

四,、細(xì)胞計數(shù)要點

1,、進行細(xì)胞計數(shù)時，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于10⁴個/ml,，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中,；

2,、要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性,。

3,、取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液,，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻,，以求計數(shù)準(zhǔn)確；

4,、數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞,，若細(xì)胞聚集成團時，只按照一個細(xì)胞計算,。如果細(xì)胞壓在格線上時,，則只計上線，不計下線,，只計右線,，不計左線。

5,、操作時,，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中,，否則要重新計數(shù),。

只要滿足以下兩個條件就可以進行細(xì)胞活力檢測，正常細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的,。

Propidium iodide（PI碘化丙啶）是一種核酸染料,，常用于細(xì)胞凋亡(apoptosis)或細(xì)胞壞死(necrosis)的檢測和流式細(xì)胞儀分析。PI不能通過正常完整的細(xì)胞膜,，故細(xì)胞在處于壞死或晚期凋亡時細(xì)胞膜被破壞,，這時可為PI著紅色，可以用來分辨壞死細(xì)胞/正常細(xì)胞,。

加入另一種可以透過細(xì)胞膜的核酸染料,，就可以通過兩種染料將活細(xì)胞和死細(xì)胞區(qū)分開。

PI經(jīng)常被用來與Calcein-AM或者FDA等熒光探針一起使用,，能同時對活細(xì)胞和死細(xì)胞染色,。PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535 nm和615 nm。