原代細(xì)胞培養(yǎng)成功以后，需要進(jìn)行分離培養(yǎng),，否則細(xì)胞會(huì)因生存空間不足或密度過大,，營養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長,。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng),。傳代細(xì)胞允許培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增(形成細(xì)胞株)，可以進(jìn)行細(xì)胞克隆,，易于保存,，但可能喪失一些特殊的細(xì)胞和分化特征。傳代細(xì)胞形成細(xì)胞株的zui大利處在于提供了大量持久的實(shí)驗(yàn)材料,，便于實(shí)驗(yàn),。
1. 操作步驟
（1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
（2）向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量,。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜,。
（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進(jìn)行消化,，2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮,、細(xì)胞間隙增大后,，應(yīng)立即中止消化。
（4）吸出消化液,，向瓶內(nèi)加入Hanks液少量,，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉,，然后再加培養(yǎng)液,。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后,，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液,，終止消化。
（5）使用彎頭吸管,，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液,。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔,，以防用力過猛損傷細(xì)胞。
（6）用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中,，置CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
（7）細(xì)胞培養(yǎng)換液時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)要求來確定,。一般2～3d后應(yīng)換一次生長液,。待細(xì)胞鋪滿器皿底面，即可使用,；也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液,。
2. 注意事項(xiàng)
（1）掌握好細(xì)胞消化的時(shí)間，消化時(shí)間過短時(shí),，細(xì)胞不宜從瓶壁脫落,，過長的消化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脫落、損傷,。
（2）掌握好消化濃度,，當(dāng)消化液濃度過高時(shí)，消化時(shí)間應(yīng)縮短,，過低時(shí)細(xì)胞消化時(shí)間相對延長,。
三、體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)及其操作步驟
1． 瘤細(xì)胞懸液接種
（1）無菌選取生長良好(有光澤,，淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細(xì)胞,。   
（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經(jīng)80～100目篩網(wǎng)過濾成細(xì)胞懸液,。
（3）培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用PBS洗兩遍,。
（4）計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至107～108／ml。
（5）常規(guī)消毒后,，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細(xì)胞懸液(0.1ml／部位,，＞106細(xì)胞)。初次接種成功率低,，細(xì)胞數(shù)盡可能多一些,。
（6）次日注意觀察動(dòng)物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期,，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短,，zui后固定為一個(gè)相對穩(wěn)定的時(shí)間。
2． 腹水瘤的建立與腹水瘤的接種　將實(shí)體瘤細(xì)胞直接種于小鼠腹腔,、腹壁或其他部位,，引起腹水，腹水中含有瘤細(xì)胞,，將這種腹水反復(fù)傳代,，即可成為腹水瘤。初次傳代時(shí),，腹水常呈血性(含大量紅細(xì)胞),，反復(fù)傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下,。
（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細(xì)胞離心和洗滌,，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
（2）消毒動(dòng)物,，左下腹穿刺接種106腹水瘤細(xì)胞,。
（3）接種腹水瘤細(xì)胞后約7~12d，待小鼠腹部明顯膨大,。用碘酒棉球消毒小鼠腹部,，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后,，用滴管吸取,。每只小鼠可抽3~5ml。
（4）抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min,，收集上清,，分裝凍存?zhèn)溆谩?br />四、培養(yǎng)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇
細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù),。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中,，儲(chǔ)存時(shí)間幾乎是無限的,。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。
1． 凍存細(xì)胞
（1）選對數(shù)增生期細(xì)胞(證明無支原體污染),，在凍存前1d換液,。
（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計(jì)數(shù),，使細(xì)胞密度達(dá)5×107／ml左右密度,，離心，去上清,。
（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml,，小牛血清2ml，DMSO 1ml,，5.6%NaHCO3 0.1ml）,，按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸,。凍存細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油,，可使冰點(diǎn)降低，使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外,。
（4）分裝于無菌凍存管中,，每管加1.5m懸液。
（5）旋好凍存管并仔細(xì)檢查,，一定要蓋緊,，做好標(biāo)記。
（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中,，按-1℃／min的速度,，在30～40min時(shí)間內(nèi)，下降到液氮表面,，再停30min后,，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度,，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,，太慢則促進(jìn)冰晶形成。
操作時(shí)應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套,，以免液氮凍傷,。
2. 復(fù)蘇細(xì)胞
（1）從罐中取出凍存管。
（2）迅速放入36℃～37℃水浴,，不時(shí)搖動(dòng),，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成,。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后,，打開蓋子,，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液,。
（4）低速離心(500～1000r／min) 5min,，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。
（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后,，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后,，繼續(xù)培養(yǎng),。以后仍按常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。
凍存細(xì)胞數(shù)量要充分,，密度應(yīng)達(dá)到107／ml,，在融后稀釋20倍時(shí)，仍能保持5×105／ml數(shù)量,。

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