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一、液體樣本
液體樣本處理原則:所有的液體樣本,,用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),,如果以后碰到其他的液體樣本,,也按這個方法,納入?yún)R總表,。
1,、血清:用無菌管收集,室溫血液自然凝固10-20分鐘,,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),,仔細收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,,應再次離心,。
2、血漿:應根據(jù)標本的要求選擇EDTA,、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑,,混合10-20分鐘后,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),,仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心,。
3,、尿液:用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心,。
4,、胸腹水:用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),,仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
5,、腦脊液:用無菌管收集,,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心。
6,、唾液:用無菌管收集,,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心。
7,、細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,,用無菌管收集。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),,仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心,。
8,、牛奶:用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),,仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心,。
9,、蜂蜜:用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),,仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心,。
10,、全血:用含有抗凝劑的無菌管收集,立即輕輕搖動,,來回輕輕顛倒數(shù)次,,使血液和抗凝劑混勻,以防血液凝固,。
二,、固體樣本
固體樣本處理原則:稱取1g的固體樣本,用9g的合適緩沖液溶解,分泌蛋白可以直接離心取上清檢測,,細胞內(nèi)的蛋白,,要先收集細胞,再用合適方法破碎,,離心取上清測試,。
1、組織標本:切割標本后,,稱取1g組織,,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),,仔細收集上清。分裝一份待檢測,,其余冷凍備用,保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心,。對于植物組織,不好勻漿的話,,就在液氮中充分研磨,;
2、細胞內(nèi)蛋白樣本
許多待測蛋白不是分泌蛋白,,而是存在于細胞內(nèi)的蛋白,,這個時候,要先收集細胞,,洗滌干凈,,再破碎細胞,離心取上清,。
(1)培養(yǎng)的細胞
A,、動物細胞:用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液,使細胞濃度達到100萬/ml左右,。通過反復凍融(如果反復凍融,,破碎效果不好,就采用超聲波破碎),,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心。
B、植物細胞:用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液,,使細胞濃度達到100萬/ml左右,,置于冰盒上,用超聲破碎儀,,設(shè)置破碎2s,,冷卻30s的方式,充分破碎細胞,,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心。
(2)組織的細胞
切割標本后,,稱取1g組織,,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),,去除上清,再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細胞三遍,。再用上述的細胞破碎方法破碎細胞,。
3、土壤:稱取1g土壤,,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,,用手工將標本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),,仔細收集上清,。分裝一份待檢測,其余冷凍備用,,保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心。如果是測分泌蛋白,,直接取上清檢測,,測試細胞內(nèi)蛋白,要破碎細胞,。
4,、咽拭子:加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS,溶解咽拭子頭部,,搖勻,,用鑷子取出咽拭子并擠干液體,,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細收集上清,。分裝一份待檢測,,其余冷凍備用,保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心,。如果是測分泌蛋白,直接取上清檢測,,測試細胞內(nèi)蛋白,,要破碎細胞。
5.植物標本中相關(guān)酶或蛋白的測定:(粗提?。?br />1,、新鮮植物組織請在液氮中充分研磨;
2,、加入樣品體積9倍的提取液(pH?7.4?PBS緩沖液),3,、?請于4度,8000rpm,,離心30分鐘,,取上清并暫時保存于4度待用。
三,、樣本收集注意事項
1、不能檢測含NaN3的樣品,,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性,。
2、標本采集后盡快進行實驗,,若不能馬上進行試驗,,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融,。
3,、我們羅列的是通用的樣本處理方法,無法涵蓋各種樣本,,對于一些特殊樣本,,建議實驗人員多參考已發(fā)表的文獻,自行設(shè)計合理的樣本處理方法,。
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