【檢驗原理】

本試劑盒針對小反芻獸疫病毒的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針,，在反應體系中含小反芻獸疫病毒基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號,。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,，實現檢測結果的定性分析,。

【主要組成成份】

注：陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA，陽性對照為失去活性的小反芻獸疫病毒cDNA,。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復凍融，有效期12個月,。

【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 ,、Roche LightCycler R480,、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀,。

【樣本要求】

1. 適用標本類型：發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內容物及組織臟器(腸道組織,、腸系膜及淋巴結等)和病毒培養(yǎng)液,。

2. 標本采集，方法如下：

(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml,，轉至5ml 的干燥管中,，密閉送檢。

(2) 腸內容物：無菌條件下取腸道內容物約1g 左右,，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中,，立即送檢。

(3) 組織臟器：取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結等組織約1g,，置一1.5ml的潔凈離心管中,，密閉送檢。

3.應避免標本間交叉污染,。

4.標本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存,；如需長期保存,，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融,。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應數（n）,，并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量,。

n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數

（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管,。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN,、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl,、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管,，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增,。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,，設置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

 （1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35,。

 （2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期,。

2.標本結果判定：

（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期,。

（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時應對標本進行重復檢測,，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內,，有明顯指數增長期，則判定為陽性,，否則為陰性,。

（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】