預(yù)期用途】

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,，FMDV) 屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，主要侵害偶蹄獸,，有O,、A、C,、SAT1,、SAT2、SAT3和Asia-I七個血清型,?？谔阋甙l(fā)病以發(fā)熱、口腔黏膜及蹄部和乳房皮膚發(fā)生水泡和潰爛為特征,，是國際獸疫局規(guī)定的A類傳染病,，易通過空氣傳播，傳染性強(qiáng),，流行迅速,，偶爾感染人。由于口蹄疫傳播迅速,、難于防治,、補(bǔ)救措施少，被稱為畜牧業(yè)的“頭號殺手",。

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,，定性檢測口蹄疫O型病毒（FMDV-O)，對FMDV-O引起的偶蹄獸類病的診斷和監(jiān)控具有重要指導(dǎo)意義,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對口蹄疫病毒O型的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,，在反應(yīng)體系中含口蹄疫病毒O型基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號,。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA,，陽性對照為失去活性的FMDV-O病毒cDNA,。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融,，有效期12個月,。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列 ,、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

新鮮采集的咽拭子,、皰疹液和糞便標(biāo)本,，并使用滅菌生理鹽水懸浮。

2.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染,。

3.標(biāo)本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存,；如需長期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融,。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量,。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管,。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN,、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本RNA各5 μl,、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

 （1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35,。

 （2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期,。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期,。

（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性，否則為陰性,。

（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值,。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的檢出可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集,、運(yùn)輸,、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集,、運(yùn)輸,、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果,。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的檢出限為10² Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項(xiàng)】

1. 整個檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū),、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器,、耗材應(yīng)獨(dú)立使用,，不能混用；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭,；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置,。

2. 為避免RNA降解,，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理,。

3. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照,。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時(shí)離心。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),，并單獨(dú)存放,。

6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記,。

7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置,；不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,，淬滅基因選擇None,。

9. 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄,。