詳解核酸分離純化的原理和步驟
閱讀：23427 發(fā)布時間：2018-10-15
核酸分離純化技術是生物化學與分子生物學的一項基本技術,。隨著分子生物學技術廣泛應用于生物學,、醫(yī)學及其相關等領域，核酸分離純化技術也得到進一步發(fā)展,。各種新方法,、經(jīng)完善后的傳統(tǒng)經(jīng)典方法以及商品試劑方法的不斷出現(xiàn)，極大地推動了分子生物學的發(fā)展?，F(xiàn)就核酸分離與純化的原理及其方法學進展作一總結,。
核酸分離純化的原則核酸在細胞中總是與各種蛋白質(zhì)結合在一起的,。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖,、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開,。在分離核酸時應遵循以下原則：保證核酸分子一級結構的完整性；排除其他分子污染,。核酸分離純化的步驟大多數(shù)核酸分離純化的方法一般都包括了細胞裂解,、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離,、核酸純化等幾個主要步驟,。每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯(lián)合實現(xiàn)。
1,、細胞裂解：核酸必須從細胞或其他生物物質(zhì)中釋放出來,。細胞裂解可通過機械作用、化學作用,、酶作用等方法實現(xiàn),。a. 機械作用：包括低滲裂解、超聲裂解,、微波裂解,、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機械力使細胞破碎,，但機械力也可引起核酸鏈的斷裂，因而不適 用于高分子量長鏈核酸的分離,。有報道超聲裂解法提取的核酸片段長度從< 500bp ～ > 20kb 之間,，而顆粒勻漿法提取的核酸一般< 10kb。b. 化學作用：在一定的p H 環(huán)境和變性條件下,，細胞破裂,，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸被釋放到水相,。上述變性條件可通過加熱,、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100 ,、Tween 20 ,、NP-40 、CTAB,、sar-cosyl ,、Chelex-100 等) 或強離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍,、肌酸胍) 而獲得,。而p H 環(huán)境則由加入的強堿(NaOH) 或緩沖液 ( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 環(huán)境下,，表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解,、蛋白質(zhì)和多糖沉淀，緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ ,、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護核酸不被降解,。c. 酶作用：主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細胞破裂,，核酸釋放,。蛋白酶還能降解與核酸結合的蛋白質(zhì)，促進核酸的分離,。其中溶菌酶能催化細菌細胞壁(cell wall)的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解,。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵，其在65 ℃及有EDTA,、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時仍保留酶活性,，這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用,、機械作用,、化學作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細 胞類型,、待分離的核酸類型及后續(xù)實驗目的來確定,。
2、酶處理：在核酸提取過程中,，可通過加入適當?shù)拿甘共恍枰奈镔|(zhì)降解,，以利于核酸分離純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì),，滅活核酸酶(DNase 和RNase),，DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。
3,、核酸分離純化：核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質(zhì),、多糖、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性,，根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異,，用選擇性沉淀、層析,、密度梯度離心等方法可將核酸分離,、純化。a. 酚提取/ 沉淀法：核酸分離的一個經(jīng)典方法是酚∶氯仿抽提法,。細胞裂解后離心分離含核酸的水相,，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1 體積) 混合液,。依據(jù)應用目的，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離,。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機相,，核酸則被留于上層水相。酚是一種有機溶劑,，預先要用STE 緩沖液飽和,，因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃,，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián),；故在制備酚飽和液時要加 入82羥基喹嚀，以防止酚氧化,。氯仿可去除脂肪,，使更多蛋白質(zhì)變性，從而提高提取效率,。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡,。核酸鹽可被一些有機溶劑沉 淀,通過沉淀可濃縮核酸，改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子,。典型的例子是在酚,、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5,，終濃度為0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后,，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷，在酸性環(huán)境中促進核酸的疏水復性,。然后加入2～2. 5 倍體積的乙醇,，經(jīng)一定時間的孵育，可使核酸有效地沉淀,。其他的一些有機溶劑[ 異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨,、8. 0mol/ L 的氯化鋰,、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀。不同的離子對一些酶有抑制作用或可影響核酸的沉淀和溶解, 在實際使用時應予以選擇,。經(jīng)離心收集,，核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的鹽分，即可獲得純化的核酸,。b. 層析法：層析法是利用不同物質(zhì)某些理化性質(zhì)的差異而建立的分離分析方法,。包括吸附層析、親和層析,、離子交換層析等方法在內(nèi)的層析法,。因分離和純化同步進 行,并且有商品試劑盒供應,而被廣泛應用于核酸的純化,。在一定的離子環(huán)境下，核酸可被選擇性地吸附到硅土,、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離,。另外一些 選擇性吸附方法以經(jīng)修飾或包被的磁珠作為固相載體，磁珠可通過磁場分離而無需離心,，結合至固相載體的核酸可用低鹽緩沖液或水洗脫,。該法分離純化核酸，具有 質(zhì)量好,、產(chǎn)量高,、成本低、快速,、簡便,、節(jié)省人力以及易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點。玻璃粉或玻璃珠被證實為一種有效的核酸吸附劑,。在高鹽溶液中,， 核酸可被吸附至玻璃基質(zhì)上，離液鹽碘化鈉或高氯酸鈉可促進DNA 與玻璃基質(zhì)的結合,。Dederich 等用酸洗玻璃珠分離純化核酸,，獲得高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA。在該方法中,，細胞在堿性環(huán)境下裂解,，裂解液用醋酸鉀緩沖液中和后，直接加至含異丙醇的玻璃珠濾板,， 被異丙醇沉淀的質(zhì)粒DNA 結合至玻璃珠,，用80 %乙醇真空抽洗除去細胞殘片和蛋白質(zhì)沉淀。后用含RNase A 的TE 緩沖液洗脫與玻璃珠結合的DNA,，獲得的DNA 可直接用于測序,。
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