詳解核酸分離純化的原理和步驟
閱讀：23433 發(fā)布時(shí)間：2018-10-15
核酸分離純化技術(shù)是生物化學(xué)與分子生物學(xué)的一項(xiàng)基本技術(shù),。隨著分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及其相關(guān)等領(lǐng)域,，核酸分離純化技術(shù)也得到進(jìn)一步發(fā)展,。各種新方法、經(jīng)完善后的傳統(tǒng)經(jīng)典方法以及商品試劑方法的不斷出現(xiàn),，極大地推動了分子生物學(xué)的發(fā)展?，F(xiàn)就核酸分離與純化的原理及其方法學(xué)進(jìn)展作一總結(jié)。
核酸分離純化的原則核酸在細(xì)胞中總是與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的,。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì),、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開,。在分離核酸時(shí)應(yīng)遵循以下原則：保證核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性,；排除其他分子污染。核酸分離純化的步驟大多數(shù)核酸分離純化的方法一般都包括了細(xì)胞裂解,、酶處理,、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個(gè)主要步驟,。每一步驟又可由多種不同的方法單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)現(xiàn),。
1、細(xì)胞裂解：核酸必須從細(xì)胞或其他生物物質(zhì)中釋放出來,。細(xì)胞裂解可通過機(jī)械作用,、化學(xué)作用、酶作用等方法實(shí)現(xiàn),。a. 機(jī)械作用：包括低滲裂解,、超聲裂解,、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法,。這些方法用機(jī)械力使細(xì)胞破碎,，但機(jī)械力也可引起核酸鏈的斷裂，因而不適 用于高分子量長鏈核酸的分離,。有報(bào)道超聲裂解法提取的核酸片段長度從< 500bp ～ > 20kb 之間,，而顆粒勻漿法提取的核酸一般< 10kb。b. 化學(xué)作用：在一定的p H 環(huán)境和變性條件下,，細(xì)胞破裂,，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸被釋放到水相,。上述變性條件可通過加熱,、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100 ,、Tween 20 ,、NP-40 、CTAB,、sar-cosyl ,、Chelex-100 等) 或強(qiáng)離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍,、肌酸胍) 而獲得,。而p H 環(huán)境則由加入的強(qiáng)堿(NaOH) 或緩沖液 ( TE、STE 等) 提供,。在一定的p H 環(huán)境下,，表面活性劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,，緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ ,、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護(hù)核酸不被降解。c. 酶作用：主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K,、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細(xì)胞破裂,，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),，促進(jìn)核酸的分離,。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁(cell wall)的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,，其在65 ℃及有EDTA,、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時(shí)仍保留酶活性，這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實(shí)際工作中,酶作用,、機(jī)械作用,、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細(xì) 胞類型,、待分離的核酸類型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定,。
2、酶處理：在核酸提取過程中,，可通過加入適當(dāng)?shù)拿甘共恍枰奈镔|(zhì)降解,，以利于核酸分離純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì),，滅活核酸酶(DNase 和RNase),，DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸,。
3,、核酸分離純化：核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質(zhì)、多糖,、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性,，根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異，用選擇性沉淀,、層析,、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化,。a. 酚提取/ 沉淀法：核酸分離的一個(gè)經(jīng)典方法是酚∶氯仿抽提法,。細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1 體積) 混合液,。依據(jù)應(yīng)用目的,，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相,，核酸則被留于上層水相,。酚是一種有機(jī)溶劑，預(yù)先要用STE 緩沖液飽和,，因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸,。酚也易氧化發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián),；故在制備酚飽和液時(shí)要加 入82羥基喹嚀,，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,，使更多蛋白質(zhì)變性,，從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可被一些有機(jī)溶劑沉 淀,通過沉淀可濃縮核酸,，改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子,。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5,，終濃度為0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負(fù)電荷,，在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性,。然后加入2～2. 5 倍體積的乙醇，經(jīng)一定時(shí)間的孵育,，可使核酸有效地沉淀,。其他的一些有機(jī)溶劑[ 異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨,、8. 0mol/ L 的氯化鋰,、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀。不同的離子對一些酶有抑制作用或可影響核酸的沉淀和溶解, 在實(shí)際使用時(shí)應(yīng)予以選擇,。經(jīng)離心收集,，核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的鹽分，即可獲得純化的核酸,。b. 層析法：層析法是利用不同物質(zhì)某些理化性質(zhì)的差異而建立的分離分析方法,。包括吸附層析、親和層析,、離子交換層析等方法在內(nèi)的層析法,。因分離和純化同步進(jìn) 行,并且有商品試劑盒供應(yīng),而被廣泛應(yīng)用于核酸的純化。在一定的離子環(huán)境下,，核酸可被選擇性地吸附到硅土,、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離。另外一些 選擇性吸附方法以經(jīng)修飾或包被的磁珠作為固相載體,，磁珠可通過磁場分離而無需離心,，結(jié)合至固相載體的核酸可用低鹽緩沖液或水洗脫。該法分離純化核酸,，具有 質(zhì)量好,、產(chǎn)量高、成本低,、快速,、簡便、節(jié)省人力以及易于實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn),。玻璃粉或玻璃珠被證實(shí)為一種有效的核酸吸附劑,。在高鹽溶液中,， 核酸可被吸附至玻璃基質(zhì)上，離液鹽碘化鈉或高氯酸鈉可促進(jìn)DNA 與玻璃基質(zhì)的結(jié)合,。Dederich 等用酸洗玻璃珠分離純化核酸,，獲得高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA。在該方法中,，細(xì)胞在堿性環(huán)境下裂解,，裂解液用醋酸鉀緩沖液中和后，直接加至含異丙醇的玻璃珠濾板,， 被異丙醇沉淀的質(zhì)粒DNA 結(jié)合至玻璃珠,，用80 %乙醇真空抽洗除去細(xì)胞殘片和蛋白質(zhì)沉淀。后用含RNase A 的TE 緩沖液洗脫與玻璃珠結(jié)合的DNA,，獲得的DNA 可直接用于測序,。
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