原標(biāo)題:超液相色譜?四極桿?飛行時(shí)間質(zhì)譜法快速篩查農(nóng)藥制劑中非法添加的殺蟲劑
摘要:建立了農(nóng)藥制劑中 48 種非法添加殺蟲劑的超液相色譜?四極桿?飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC?Q?TOF MS)快速 篩查方法,。 可濕性粉劑、乳油和懸浮劑 3 種劑型的農(nóng)藥制劑樣品經(jīng)甲醇溶解,、提取后,,采用 UPLC?Q?TOF MS 檢測(cè), 48 種殺蟲劑在 0.5~ 20mg / L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,,線性相關(guān)系數(shù)(R 2)大于 0.99,。 48 種農(nóng)藥的定量限為 0.05 ~ 0.4 mg / kg,檢出限為0.01~ 0.2 mg / kg,,低,、中、高 3 個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為 86.3% ~ 101.5%,,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 為 1.7% ~4.0%,。 該方法快速、準(zhǔn)確,,可用于農(nóng)藥制劑中多種殺蟲劑的快速篩查,。
非法添加成分是指在農(nóng)藥制劑中人為添加標(biāo)稱 有效成分以外的農(nóng)藥成分。 近年來,,我國(guó)加強(qiáng)了對(duì) 有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的管理,,對(duì)甲胺磷等 高毒農(nóng)藥全面禁止生產(chǎn)和使用,對(duì)克百威等農(nóng)藥限 制在蔬菜,、水果等作物上使用,。
而有些不法商 家為了增加防治效果,、降低登記和生產(chǎn)成本,、牟取暴利,在產(chǎn)品中非法添加高毒,、禁限用的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑,。 使用含有非法添加殺蟲劑的 農(nóng)藥制劑可能造成農(nóng)藥殘留超標(biāo),,影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量 安全,導(dǎo)致作物發(fā)生藥害,,給農(nóng)民造成經(jīng)濟(jì)損失,,對(duì) 生態(tài)環(huán)境造成污染。 近年來,,農(nóng)藥制劑中非法添加 成分已引起各級(jí)農(nóng)業(yè)主管部門的高度重視,,成為監(jiān)管的重要對(duì)象。
我國(guó)有超過1100 種農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn),, 農(nóng)藥制劑中已有的檢測(cè)方法主要針對(duì)某一種或多種 有效成分的含量檢測(cè),,主要有氣相色譜(GC)法 、 液相色譜(LC)法,、光譜法等,。 非法添加成分 具有很強(qiáng)的隱蔽性和隨機(jī)性,常規(guī)的 GC 法和 LC 法 無法應(yīng)用于非法添加成分的檢測(cè),。
目前,,文獻(xiàn)報(bào)道 的農(nóng)藥非法添加成分的檢測(cè)方法有氣相色譜?質(zhì)譜 (GC?MS) 法 、液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜( HPLC? MS / MS)法,。 GC?MS 法不適用于難氣化或者高 溫下容易分解的農(nóng)藥,,HPLC?MS / MS 法雖然靈敏度 高,選擇性和特異性好,,然而不能對(duì)化合物進(jìn)行 相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)的測(cè)定,,不能建立標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜數(shù) 據(jù)庫(kù),在定性檢測(cè)方面尚有一定的欠缺,。
超液相色譜?四極桿?飛行時(shí)間質(zhì)譜( UPLC?Q?TOF MS)依據(jù)所測(cè)得化合物的相對(duì)分子質(zhì)量,,可以 對(duì)化合物進(jìn)行定性,從而避免誤檢和漏檢 ,, 并且可以建立標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù),,能夠?qū)ξ粗獦悠?進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的篩查,。 目前,,UPLC?Q?TOF MS 廣 泛應(yīng)用于中成藥和保健品、食品添加劑 ,、獸藥和水產(chǎn)品等多個(gè)領(lǐng)域非法添加成分的 篩查,。 作者尚未見到有應(yīng)用 UPLC?Q?TOF MS 方法 篩查農(nóng)藥制劑中非法添加有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的文獻(xiàn)報(bào)道。
本研究建立了可濕性粉劑( WP),、乳油(SC) 3 種農(nóng)藥制劑中 48 種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲 劑的快速篩查方法,,為打擊在農(nóng)藥制劑中非法添加 殺蟲劑提供了有力的。
一、實(shí)驗(yàn)部分
1. 儀器與試劑
Agilent 1290 超液相色譜儀/ 6530 四極桿? 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,,MassHunter 工作站及定性分析軟 件,,PCDL個(gè)人譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)軟件; Zorbax C18柱(100 mm×1.8 mm,, 2.1 μm,,);超純水機(jī)(美國(guó) Millipore 公司),。
克百威,、丁硫克百威、硫雙威,、殺線威,、特丁 硫磷、二嗪磷,、滅線磷,、甲拌磷、硫線磷,、 馬拉硫磷,、喹硫磷、雙硫 磷,、稻豐散 等 13 種標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng),;甲萘威、甲胺磷,、滅多威,、速滅威 、乙酰甲胺磷 ,、涕滅威,、異丙威、仲丁威,、殘殺威,、氧樂果、敵 敵畏(,、久效磷,、甲基 硫環(huán)磷、樂果,、殺螟丹,、抗蚜威、 地蟲硫磷 ,、水胺硫磷,、乙嘧硫磷,、辛硫磷、 殺撲磷,、苯線磷、甲基嘧啶磷 ,、敵瘟磷 ,、氯唑磷、三唑磷,、治 螟磷,、甲基吡啶磷、甲基異柳磷 ,、毒死蜱,、毒蟲畏、蠅毒磷,、伏殺硫磷,、丙溴磷 等 35 種標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)。 甲醇,、乙腈為 LC?MS 純?cè)噭?,甲酸為色譜純?cè)?劑,實(shí)驗(yàn)用水為超純水,。
48 種殺蟲劑單標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:稱取農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品 10 mg(至 0.1 mg),,置于 25 mL 容量瓶中, 用甲醇溶解并定容,。
實(shí)驗(yàn)樣品從市場(chǎng)隨機(jī)抽取,。
2. 液相色譜條件
色譜柱為 Zorbax C18柱;色譜柱溫度為 35 ℃,; 進(jìn)樣量為 1 μL,。 流動(dòng)相:A 相為 0.1% (v / v)甲酸水 溶液,B 相為乙腈,;流動(dòng)相流速為 0.3 mL / min,。 梯 度洗脫程序:0 ~ 3.0 min, 10% B~ 40% B,; 3.0 ~ 7.0 min,, 40% B~ 90% B; 7.0 ~ 12.0 min,, 90% B,; 12.0 ~12.5 min, 90% B~10% B,。
3. 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧離子(ESI) 源,,正離子模式,;掃 描范圍:一級(jí)質(zhì)譜 m/ z 150 ~ 500,二級(jí)質(zhì)譜 m/ z 50 ~500,;霧化氣:氮?dú)?;霧化氣流量:11 L / min;噴霧氣 壓力:3.4×10 5 Pa,;干燥氣溫度 300 ℃,;毛細(xì)管電壓:3 500 V;碎裂電壓 140 V,;二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量分別 為:5,、10、20 和 40 V,。 UPLC?Q?TOF MS 配置了雙 噴霧器電噴霧源,,采集數(shù)據(jù)時(shí)可以連續(xù)導(dǎo)入?yún)⒈热?液,對(duì)儀器質(zhì)量軸進(jìn)行實(shí)時(shí)校正,,參比離子為 m/ z 121.050 9 和 m/ z 922.009 8,。
4. 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立
4.1 一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立
采用 Agilent 公司的 PCDL 軟件建立了 48 種有 機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。取標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至 2 mg / L,,按照2 和3 節(jié)的液相色 譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣,。 采集一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)(TOF?MS 模式),得到目標(biāo)化合物的保留時(shí)間,、質(zhì)量數(shù)等 信息,,通過在 PCDL 軟件中輸入每種農(nóng)藥的中英文 名稱、分子式,、相對(duì)分子質(zhì)量和保留時(shí)間,,建立 了 48 種殺蟲劑的一級(jí)質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)。
4.2 二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立
一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)建立完成后,,對(duì) 48 種殺蟲劑再 次進(jìn)樣測(cè)定,,采集二級(jí)質(zhì)譜圖,通過 PCDL 軟件建立 48 種農(nóng)藥的二級(jí)質(zhì)譜庫(kù),,二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)中包含母離 子,、保留時(shí)間、不同碰撞能量(5,、10,、20 和 40 V)下的 二級(jí)質(zhì)譜圖等信息。
5. 樣品前處理
我國(guó)登記和使用較多的農(nóng)藥制劑有可濕性粉劑,、乳油,、懸浮劑 3 種劑型,本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同劑型的樣品分別進(jìn)行處理,。
5.1 可濕性粉劑樣品的處理
準(zhǔn)確稱取 0.25 g 樣品置于 25 mL 容量瓶中,,加 入 15 mL 甲醇,,超聲溶解 10 min,冷卻至室溫,。 用 甲醇定容至 25mL,,然后轉(zhuǎn)移到 50 mL 離心管中,以3500 r/ min 的速度離心 5 min,,吸取 1 mL 上清液至 10 mL 容量瓶中,,加入 4mL 乙腈,用水定容至 10 mL,,過 0.22 μm 濾膜后進(jìn)樣測(cè)定。
5.2 乳油樣品的處理
準(zhǔn)確稱取 0.25 g 乳油樣品,,置于 25 mL 容量瓶 中,,用甲醇溶解并定容,吸取 1 mL 溶液至 10 mL 容 量瓶中,,加入 4 mL 乙腈,,用水定容至 10 mL,過 0.22 μm 濾膜后進(jìn)樣測(cè)定,。
5.3 懸浮劑樣品的處理
準(zhǔn)確稱取 0.25 g 懸浮劑樣品,,置于 25 mL 容量 瓶中,加入 5 mL 水,,振搖,,使樣品均勻分散在水中。 然后加入 15 mL 甲醇,,超聲溶解 10 min,,冷卻至室 溫。 用甲醇定容至 25 mL,,吸取 1 mL 溶液至 10 mL 容量瓶中,,加入 4 mL 乙腈,用水定容至 10 mL,,過 0.22 μm 濾膜后進(jìn)樣測(cè)定,。
二、結(jié)果與討論
1. 樣品前處理?xiàng)l件的選擇
農(nóng)藥制劑在加工的過程中,,會(huì)根據(jù)劑型的不同 加入不同的助劑,。 所以,根據(jù)劑型的不同,,樣品的前 處理方法也略有不同,。
可濕性粉劑在加工的過程中需要加入載體(如 硅藻土、高嶺土)和助劑(如潤(rùn)濕劑,、分散劑)等,。 在 樣品處理過程中,,載體一般不溶解于甲醇,可通過離 心除去,。 助劑在甲醇中有一定的溶解性,,但不影響對(duì)農(nóng)藥的提取。 可濕性粉劑可以直接加入甲醇后超 聲提取,。
乳油樣品在加工的過程中加入了大量的有機(jī)溶 劑和助溶劑,,如甲醇、乙腈,、丙酮等溶劑,,由于稱取的 樣品量較少,這些溶劑均可以溶解于甲醇中,,對(duì)樣品 提取沒有影響,。
懸浮劑在加工的過程中加入了一些特殊的助劑 如分散劑、潤(rùn)濕劑等,,如直接加入甲醇,,樣品容易聚 集,不利于提取,。 因此在樣品中先加入 5mL 水,,使 樣品均勻分散在水中,再加入甲醇超聲溶解提取,。
對(duì)于這 3 種劑型的農(nóng)藥制劑,,在提取過程中,一 些干擾物質(zhì)如潤(rùn)濕劑,、分散劑等也會(huì)被提取到甲醇 溶液中,,這些物質(zhì)對(duì)分離和測(cè)定有一定的影響,但是 由于非法添加殺蟲劑的含量較高,,樣品經(jīng)過提取后 需要稀釋才能進(jìn)樣分析,,干擾物質(zhì)也同時(shí)被稀釋,從 而減少了對(duì)分析測(cè)定的影響,。經(jīng)過比較,,不經(jīng)凈化 處理的樣品對(duì)測(cè)定基本沒有影響,可直接進(jìn)樣分析,, 從而減少了樣品前處理造成的損失,,提高了回收率。
2. 液相色譜條件的優(yōu)化
一般檢測(cè)農(nóng)藥常用乙腈?水或甲醇?水兩種混合 溶劑體系作為流動(dòng)相,,首先對(duì)這兩種體系作流動(dòng)相 進(jìn)行了對(duì)比,。 結(jié)果表明,使用乙腈?水體系做流動(dòng)相 時(shí),,48 種殺蟲劑的色譜峰形較好,,峰形對(duì)稱,,響應(yīng)值 也高于以甲醇?水為流動(dòng)相時(shí)的響應(yīng)值,采用乙腈? 水體系的壓力較低,,有利于色譜柱的壽命和儀器的 保護(hù),。 之后考察了酸對(duì)分離和靈敏度的影響,結(jié)果 表明,,以乙腈?0.1% (v / v)甲酸水溶液為流動(dòng)相得到 了*的峰形和色譜分離效果,。 在流動(dòng)相中加入 0.1% (v / v)甲酸,有助于提高化合物的離子化效 率,,提高靈敏度,。 因此選擇以乙腈?0.1%(v / v)甲酸 水溶液作為流動(dòng)相。
3. 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
采用正離子掃描模式,,優(yōu)化了 48 種殺蟲劑的準(zhǔn) 分子離子峰,,選擇強(qiáng)度大的準(zhǔn)分子離子峰可以提高 分析的靈敏度和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的穩(wěn)定性與得分。 經(jīng)過優(yōu)化,,在 ESI +模式下,,水胺硫磷[M+Na]+的強(qiáng) 度大于[M+H]+的強(qiáng)度,,其余 47 種農(nóng)藥的[M+H]+強(qiáng)度zui大,。如表 1 所示,為了實(shí)現(xiàn)對(duì) 48 種殺蟲劑的 譜庫(kù)檢索定性檢測(cè),,所獲得的二級(jí)質(zhì)譜圖在高質(zhì)量 區(qū)和低質(zhì)量區(qū)的碎片都非常重要,,因此,每種殺蟲劑 均獲得 4 個(gè)不同碰撞能量下的二級(jí)質(zhì)譜圖,,在進(jìn)行 譜庫(kù)檢索時(shí),,低碰撞能量的質(zhì)譜圖有利于判斷主要 碎片,而高碰撞能量的質(zhì)譜圖可以得到更多質(zhì)譜碎 片信息,,能夠更準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物的定性,。 根據(jù) 試 驗(yàn)結(jié)果選擇4個(gè)碰撞能量( 5、10,、20和40 V) ,,可以實(shí)現(xiàn)每種殺蟲劑在高質(zhì)量區(qū)和低質(zhì)量區(qū)獲得足 夠的質(zhì)譜碎片信息。 48 種農(nóng)藥的準(zhǔn)分子離子[M+ H]+或者[M+Na]+的實(shí)測(cè) Mr 和通過 Mr 計(jì)算軟件 計(jì)算出的每種殺蟲劑的理論 Mr 值見表 1,。 按照前 述優(yōu)化的條件對(duì) 48 種殺蟲劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行 檢測(cè),,得到總離子流圖(見圖 1)。
4. 定性分析
先對(duì)樣品進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描,,通過一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)采集到的一級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行自動(dòng)檢索,,軟件 根據(jù)實(shí)測(cè)離子與數(shù)據(jù)庫(kù)中的保留時(shí)間、質(zhì)量,、同 位素分布和同位素比例等因素的匹配度進(jìn)行綜合評(píng) 分,,將檢索得分≥85 的樣品確定為陽(yáng)性樣品,。 再利 用二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)一步確證。 樣 品經(jīng)過二次進(jìn)樣測(cè)定,,對(duì)陽(yáng)性樣品中疑似非法添加 的殺蟲劑進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,,將采集到的二級(jí)質(zhì)譜 圖通過已建立的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,根據(jù)離 子精度,、同位素比例,、同位素豐度等因素進(jìn)行綜合評(píng) 分,將得分≥75 的農(nóng)藥確定為非法添加的殺蟲劑,。
為了考察本文所建立的篩查方法對(duì) 48 種殺蟲劑篩查結(jié)果的可靠性,,采用已建立的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù) 庫(kù)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣品中添加了 48種殺蟲劑 的可濕性粉劑、乳油,、懸浮劑樣品進(jìn)行自動(dòng)檢索,,結(jié)果見表 1。
5. 線性關(guān)系,、定量限,、檢出限、回收率和精密度
配制 0.5~20 mg / L 范圍的標(biāo)準(zhǔn)溶液,,以化合物 的準(zhǔn)分子離子峰作為定量離子,,在本文所述的色譜 條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以提取離子色譜圖的 峰面積(Y)為縱坐標(biāo),、質(zhì)量濃度(X,, mg / L)為橫坐 標(biāo)進(jìn)行回歸分析。 結(jié)果表明,,48 種殺蟲劑的線性相 關(guān)系數(shù)R2 均大于 0.99,,說明本方法適用于農(nóng)藥制 劑中 48 種殺蟲劑的定量分析。 對(duì)篩查出的非法添 加殺蟲劑進(jìn)行定量分析時(shí),,使用寬度為 20×10 -6(20 ppm)的質(zhì)量偏差對(duì)一級(jí)全掃描總離子流圖提取離 子色譜圖,,采用外標(biāo)法以提取離子色譜峰的峰面積 進(jìn)行定量分析。
以定量離子 10 倍信噪比(S / N)的響應(yīng)值對(duì)應(yīng) 的質(zhì)量濃度為方法定量限(LOQ),;以一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù) 庫(kù)檢索得分≥85 和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得分≥75 的篩查zui低質(zhì)量濃度作為方法的檢出限(LOD) (見 表 2),。 選擇可濕性粉劑、乳油,、懸浮劑空白樣品進(jìn) 行加標(biāo)回收試驗(yàn),,選取 0.5、1.0 和 5.0 mg / kg 3 個(gè)添加水平,,每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定 3 次,,48 種殺蟲劑在 3 種劑型中的加標(biāo)回收率為86.3% ~ 101.5%,相對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)偏差(RSDs)為 1.7% ~4.0% (見表 2)。
6. 實(shí)際樣品的篩查
從上海郊區(qū) 9 個(gè)區(qū)(縣)的農(nóng)資門店抽取了 100 份樣品,,應(yīng)用本方法進(jìn)行快速篩查及含量分析,,結(jié)果見表 3。 在 100 個(gè)樣品中,,有9個(gè)樣品檢出非法添 加的殺蟲劑,,9 份樣品的一級(jí)質(zhì)譜檢索得分≥85,二 級(jí)質(zhì)譜檢索得分≥75,,非法添加成分的含量均大于1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),。
三、結(jié) 論
建立了可濕性粉劑,、乳油,、懸浮劑等 3 種農(nóng)藥制 劑中 48 種殺蟲劑的 UPLC?Q?TOF MS 篩查方法。 該方法具有快速,、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),,能有效避免樣品 的誤檢和漏檢,可以滿足農(nóng)藥制劑中非法添加成分 的快速篩查和定量要求,。 本次抽取的 100 份樣品中 篩查出了我國(guó)在蔬菜,、水果等作物上禁止或者限制 使用的農(nóng)藥,如克百威,、滅多威,、馬拉硫磷等,這些農(nóng) 藥使用后,,可能引起作物藥害,、農(nóng)產(chǎn)品殘留超標(biāo)等一系列嚴(yán)重后果,,危害到人民群眾的身體健康和農(nóng)民 的經(jīng)濟(jì)利益,。 通過對(duì)非法添加成分的快速篩查,能 夠從源頭加強(qiáng)農(nóng)藥質(zhì)量的管理,,確保農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和農(nóng)民的利益,,為相關(guān)的監(jiān)管部門提供。(來源:北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)) 試劑,、標(biāo)準(zhǔn)品:
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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