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提效減耗！HPLC方法如何轉(zhuǎn)換為UHPLC方法,？
哈嘍,，上期小編帶領(lǐng)大家簡單了解了下高效液相色譜和超高效液相色譜的差異，相信大家通過小編的介紹對兩者有了比較具體的了解,。那么隨著小粒徑色譜柱的發(fā)展,，越來越多的業(yè)內(nèi)人士期望使用亞2μm粒徑色譜柱的超高效液相色譜來拓寬選擇性,、提高工作效率、降低耗能,、減少污染,。
今天小編就帶領(lǐng)大家看下如何將HPLC方法轉(zhuǎn)換為UHPLC方法。
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保證轉(zhuǎn)換成功的前提
● 相同的選擇性：選擇相同品牌,，相同鍵合工藝制成的填料僅僅是粒徑不一致,。
● 相同或者更大的柱長粒徑比：這是保證具有相當(dāng)或者更高的理論塔板數(shù)。
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方法如何轉(zhuǎn)換
● 針對兩者差異進(jìn)行轉(zhuǎn)換研究：色譜柱填料粒徑不同,，系統(tǒng)體積不同,，儀器輸送流動相系統(tǒng)內(nèi)徑不同，影響流速,，進(jìn)樣量,，梯度洗脫程序。
● 需要調(diào)整參數(shù)：流速,，進(jìn)樣量,，梯度洗脫程序,。
1. 流速與柱半徑的平方成正比
例如：
HPLC柱：4.6*150mm,，5μm 流速：1.5mL/min
UHPLC柱：2.1*100mm，1.8μm流速則為：
2. 樣品濃度不改變,，進(jìn)樣體積與柱體積成正比
例如：
HPLC柱：4.6*150mm,，5μm 進(jìn)樣體積：20μL
UHPLC柱：2.1*100mm，進(jìn)樣體積則為：
3. 梯度洗脫程序的轉(zhuǎn)換
等度方法只需要調(diào)整流速和進(jìn)樣量,，如果是梯度洗脫則需調(diào)整梯度洗脫程序,。調(diào)整的依據(jù)，需計算在幾何縮放的流速下輸送相同倍數(shù)柱體積溶劑到目標(biāo)柱需要的時間,。
同時,，由于不同儀器之間系統(tǒng)體積存在差異，也需要在轉(zhuǎn)換時加以考慮,。梯度程序轉(zhuǎn)換的計算過程這里不做詳細(xì)描述,。通常色譜儀器均配備轉(zhuǎn)換軟件，輸入原始洗脫程序,，軟件可自動計算并轉(zhuǎn)換為目標(biāo)儀器的洗脫,，然后根據(jù)色譜峰分離情況進(jìn)行人工微調(diào)。
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方法參數(shù)的優(yōu)化
1. 改善分離度：調(diào)整梯度洗脫程序,，增加長度是便捷可行的措施,；
2. 如果破壞試驗(yàn)檢測的雜質(zhì)情況不一致，轉(zhuǎn)換后的雜質(zhì)多且物料平衡優(yōu)于前者,，兩者測定結(jié)果沒有明顯區(qū)別,，轉(zhuǎn)換成功,；
3. 如果結(jié)果明顯不一致，或涉及不合格情況,，應(yīng)匯報相關(guān)負(fù)責(zé)人,，是否需要對原方法進(jìn)行再評估或放棄方法轉(zhuǎn)換。
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什么時候?yàn)檗D(zhuǎn)換失敗
1. 原則：系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)不符合要求,；
2. 分離度調(diào)整后達(dá)不到要求,；
3. 破壞性實(shí)驗(yàn)檢測出來物料平衡明顯不如HPLC法，方法優(yōu)化后不能解決,；
4. 檢測結(jié)果與HPLC不一致,，甚至出現(xiàn)不合格，那需要對原方法進(jìn)行評估或者放棄方法轉(zhuǎn)換,。
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UHPLC轉(zhuǎn)換方法需要驗(yàn)證的項(xiàng)目
1. 原則：系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)符合要求,；
2. 峰純度達(dá)到要求；
3. 分離度達(dá)到要求,；
4. 靈敏度達(dá)到要求,；
5. 沒有系統(tǒng)適用性要求的項(xiàng)目進(jìn)行樣品2-3種條件的破壞性實(shí)驗(yàn)，雜質(zhì)分離和物料平衡均要相當(dāng),。
在日常工作中,，當(dāng)HPLC方法成功轉(zhuǎn)換為UHPLC方法后，不僅僅拓寬選擇性和提高工作效率,，還降低耗能以及減少了污染,。