1 概述
谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）是生物體內的一類重要的代謝酶，參與外源和內源有毒物質的代謝,。GST通過催化還原型的谷胱甘肽（GSH）和有毒物質偶聯(lián)反應,，使有毒化合物的水溶性增加從而更容易排出體外，最終達到解毒的作用,。利用這個原理,，將GST做成標簽表達出融合蛋白，與帶谷胱甘肽配基的親和介質特異性結合,，從而純化出目標蛋白,，再用特異性的酶將GST標簽切除從而得到天然蛋白。
2 GST標簽
GST標簽是一種常見的標簽,，它能夠增加外源蛋白的可溶性,，很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性，可在不同的宿主中表達,，適應范圍廣,，能夠提高外源蛋白的穩(wěn)定性，可用不同的蛋白酶去除且具有高特異性,，純化方便,、溫和。但它也有一定的缺點,，比如分子量較大,，可能會影響蛋白質的功能和下游實驗，因此純化后需要去除標簽，并且如果蛋白不可溶,，很難用變性的方法純化,。
3 GST親和層析
GST親和層析是利用GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價結合，通過GSH交換洗脫的原理來進行純化,。該純化柱中,，凝膠手臂上通過硫鍵結合一個GSH，然后利用其與GST-tag之間酶和底物的特異性作用力,，使得帶GST標簽的融合蛋白能夠與凝膠上的GSH結合,，從而將標簽蛋白與其他蛋白分離開。
4 月旭GST親和層析填料
5 GST融合蛋白純化步驟
1,、將GST Tanrose 4FF 裝入合適的層析柱,，層析用5倍柱體積的結合Buffer進行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下,，起到保護蛋白的作用,。
2、將樣品加到平衡好的GST Tanrose 4FF中（保證目的蛋白與GST Tanrose 4FF充分接觸,，提高目的蛋白的回收率）,，收集流出液。
3,、用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進行清洗,，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液,。
4,、使用5-10倍柱體積的洗脫Buffer，收集洗脫液,，即目的蛋白組分,。
5、依次使用3倍柱體積的結合Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料,，最后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡,，然后保存在等體積的20%的乙醇中，置于4度保存,，防止填料被細菌污染,。
6 應用實例
層析柱：PreCot 5ml GST 4FF；
樣品：重組表達GST標簽蛋白,；
結合緩沖液：20mM PB , 150mM NaCl, PH7.4,；
洗脫緩沖液：15mM還原型谷胱甘肽, 50mM Tris PH 8.0。
7 常見問題解答
1. GST蛋白結合效率低,，該怎么辦,？
①可能原因：上樣流速太快,，結合時間太短。
解決方法：降低流速,，保證足夠的結合時間,。
②可能原因：緩沖液不合適，柱子平衡不到位,。
解決方法：將緩沖液pH控制在3-12之間,，用至少5倍的柱體積平衡柱子。
③可能原因：樣品中GST融合蛋白濃度太低,。
解決方法：先濃縮樣品,，再進行純化。
④可能原因：GST蛋白發(fā)生變性或聚集,。
解決方法：選擇合適的細胞破碎方式,；發(fā)生聚集時可嘗試添加1-10mM的DTT促進蛋白溶解；GST蛋白與核酸結合或蛋白之間結合時可添加適量NaCl（100-300mM）,。
2,、GST蛋白洗脫困難,，該怎么做,？
①可能原因：洗脫強度不夠。
解決方法：增加洗脫體積數(shù),；調整洗脫緩沖液pH（8-9）或離子強度（100-300mM氯化鈉）,。
②可能原因：非特異性吸附。
解決方法：洗脫緩沖液中加入1%-2% Triton X-100,。
③可能原因：洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了,。
解決方法：洗脫緩沖液需現(xiàn)配現(xiàn)用，也可嘗試加入1-5mM的DTT,。
3. GST蛋白純化后純度太低,，該怎么做？
①可能原因：GST融合蛋白降解,。
解決方法：加入蛋白酶抑制劑防止降解,。
②可能原因：在宿主細胞內表達過程中GST標簽脫落。
解決方法：嘗試更換宿主細胞或者優(yōu)化序列,。
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