1,、適用范圍
適用于《2020版中國藥典一部》中蜂蜜中寡糖的鑒定,。
2、測試原理
試樣中的高分子糖,，經(jīng)活性炭-硅藻土柱的富集,、濃縮，再用薄層色譜法分離,、檢測,。經(jīng)過與摻有一定含量的麥芽五糖的純蜂蜜比較，來判定蜂蜜中寡糖的存在,。
3,、所需耗材和試劑
標準品： 純蜂蜜、麥芽五糖
樣品：陽性蜂蜜
試劑： 乙醇(分析純),、正丁醇(分析純),、乙酸(分析純)、二苯胺(CAS: 537-67-7),、丙酮(分析純),、苯胺、磷酸(優(yōu)級純),、超純水,。
薄層板：硅膠G板200mm×200mm，膜厚0.25mm,。使用前應(yīng)畫板,，畫板方法為下端留2cm，薄層板的寬度為2.5cm,，從下端處向上量3.5cm位置畫線,，此線為Rf值,，從下端2cm處向上量10cm位置畫線，此為爬板終點線,，爬過此線視為爬板過程結(jié)束,。畫好板后需要在110 ℃恒溫干燥箱中活化1h后，置于干燥器中放冷至室溫,，備用,。
固相萃取柱：月旭Welchrom® HON蜂蜜專用柱，規(guī)格：500mg/12mL
4,、實驗步驟
4.1 SPE 前處理步驟
活化：25mL水,，過柱流速1滴/秒；
上樣：在50mL燒杯中稱取2g試樣,，精確到1mg,，溶于10mL水后，緩慢加到月旭Welchrom® HON蜂蜜專用柱上,；
淋洗：25mL 7%乙醇水,；
洗脫：10mL 50%乙醇水，收集洗脫液,；
濃縮及復(fù)溶：收集的洗脫液置于65℃水浴中減壓濃縮至干,，殘渣加入30%乙醇1mL使之溶解，作為供試品溶液,。(溶解時候要注意確保殘渣*復(fù)溶),；
麥芽五糖標準溶液的配置：取麥芽五糖對照品，加30%乙醇制成每1mL含1mg的溶液,，作為對照品溶液,。
注：
1) 整個SPE過小柱的前處理過程都需要用固相萃取真空裝置，抽取一定的真空度以確保液體能夠滴出小柱,；
2) 旋蒸濃縮的時候應(yīng)使用盡可能小體積的茄形瓶,，推薦用25mL規(guī)格，以防止復(fù)溶的時候因接觸面積過大而損失樣品,；可以少量多次地添加溶劑進行復(fù)溶,；
3) 用超純水活化小柱時，注意在液面下降至
小柱填料上端時,，即可添加樣品溶液上樣,，切記活化過程中不能將液面抽干，否則會影響小柱對寡糖的保留效果,。
4.2 點板條件
TLC板：薄層色譜用硅膠板(涂層厚度0.2-0.25mm)
展開劑：正丙醇:水:三乙胺=60:30:0.7
顯色劑：稱取1.0g二苯胺鹽酸鹽置于盛有50.0mL丙酮的燒杯中,，再加入1mL苯胺，混合攪拌,，同時加入5mL 85%的磷酸,，此時會有白色絮狀物出現(xiàn),，*溶解后可以使用，此顯色劑要現(xiàn)用現(xiàn)配,，各種試劑要按照以上順序添加,。
注：
顯色劑的添加順序一定要按照順序添加，不可顛倒,。
4.3 具體點板過程
用10µL微量注射器在距離薄層板下端2cm的位置,，點上3.0µL的樣液，同時另取一塊薄層板,，點上同樣量經(jīng)過同樣處理的純蜂蜜和麥芽五糖標準溶液作為對照,。點樣時點越小、越集中爬板效果就越好,。然后將其放置在展開槽中(在展開劑中進行展開,，使用250mL的廣口瓶作為展開缸，加入10mL展開劑即可),，待爬板結(jié)束后(一次跑板的時間大約需用時2.5h)，用吹風機將薄層板吹干后,，均勻噴涂顯色劑,，再次吹干后，放置到110℃的烘箱中烘烤20-30min（烘烤至顯色）,，觀察顯色后的TLC板的效果,。
5、實驗結(jié)果與判斷標準
從恒溫干燥箱中取出薄層板,，觀察TLC板的顯色情況,，純蜂蜜只在Rf值0.35以上的區(qū)域有2~3個藍色中帶灰色或咖啡色的斑點，相比較麥芽五糖或混有麥芽五糖的蜂蜜卻是從原點開始呈現(xiàn)藍色帶狀樣的斑點群,。
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