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非食用著色劑酸性橙Ⅱ，Acid Orange 7,，染料索引號：C.I. 15510，是一種常用的工業(yè)染料，有強(qiáng)致癌性,。因其色澤鮮艷、勻染性好,、價格低廉等特點,，酸性橙Ⅱ常被不法商家偷偷使用于食品生產(chǎn)加工，因而酸性橙Ⅱ被列入食品中禁用著色劑的檢測范圍,。目前,，國家已經(jīng)發(fā)布3個推薦性的食品中酸性橙Ⅱ?qū)Ｓ脵z測標(biāo)準(zhǔn)，但由于不同實驗室間儀器,、人員,、實驗耗材、樣品等條件存在差異,，*執(zhí)行方法就能達(dá)到回收率,、精密度要求的情況很少。因此,，根據(jù)實際情況進(jìn)行方法的優(yōu)化是必要的,。

近，小編在用不同的基質(zhì)按照標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 3536-2013 出口食品中酸性橙Ⅱ號的檢測方法》做酸性橙Ⅱ回收實驗時,，發(fā)現(xiàn)回收率不很理想,，而且6.1.2所規(guī)定的固態(tài)樣品前處理方法非常耗時（特別是凈化前提取液需“濃縮約至10mL”這一步）。因此小編依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法對不同實驗環(huán)節(jié)進(jìn)行了一些優(yōu)化,，在這里將全過程分享給各位朋友以供參考交流~

樣品凈化步驟

樣品凈化步驟優(yōu)化涉及SPE小柱與濾膜的選擇,、固相萃取操作步驟。

首先,，我們需要按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行實驗,，驗證所用SPE小柱與濾膜是否滿足當(dāng)下實驗條件需求：

1. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)3.6節(jié)（見下圖）選擇對應(yīng)的SPE小柱。

由此,，小編選擇了月旭Welchrom® NH2小柱（500mg/6ml,30pk,，貨號：00509-11006）。

2. 使用酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液,，按標(biāo)準(zhǔn)6.1.3節(jié)的凈化方法（見下圖）進(jìn)行固相萃取操作（小柱的活化方法見3.6）,，留取每一操作步驟的樣液用于上機(jī)檢測。

在這里，小編移取0.1mL 10mg/L酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液,，加10mL水混勻作為上樣溶液,并根據(jù)6.1.3分別收集上樣液,、淋洗液、洗脫液,、二次洗脫液進(jìn)行上機(jī)檢測（此方法又稱“分步留樣”,，是分析SPE操作過程中影響回收率的環(huán)節(jié)及原因的常用方法）。

3. 選擇合適的濾膜過濾樣液,，上機(jī)檢測,。

根據(jù)6.1.3，樣液上機(jī)前要過膜凈化,。我們都知道,，濾膜作用是凈化樣液，防止雜質(zhì)污染色譜柱,。但使用濾膜（或使用不合適的濾膜）可能會影響目標(biāo)物的回收率甚至引入雜峰,。因此，小編嘗試了三種過膜方式：1) 不過膜,；2) 水系濾膜,；3) Nylon濾膜。

藍(lán)色為樣液不過膜,，峰面積12.0191

粉色為樣液過水系濾膜,，峰面積11.4695

黑色為樣液過Nylon濾膜，峰面積6.4975

結(jié)果發(fā)現(xiàn)過膜后,，過膜樣液的圖譜峰面積：過Nylon濾膜＜過水系濾膜＜不過膜,，說明過水系膜或有機(jī)系膜都對目標(biāo)物造成一定損失。因此后續(xù)實驗的樣液均不過膜上機(jī),。建議本實驗樣液上機(jī)前不過膜,。

后，小編發(fā)現(xiàn)上樣液,、淋洗液以及兩次的洗脫液中都沒有目標(biāo)物酸性橙Ⅱ檢出,，酸性橙Ⅱ終的回收率已經(jīng)達(dá)到了95%-105%，滿足了檢測的要求,。

樣品提取步驟優(yōu)化

其次，按照標(biāo)準(zhǔn)方法小編進(jìn)行了空白基質(zhì)加標(biāo)實驗,，驗證樣品提取步驟是否影響不同基質(zhì)樣品中目標(biāo)物的回收,。實驗方法如下圖所示。

實驗過程中,，小編發(fā)現(xiàn)：

6.1.2 固態(tài)試樣提取方法中提及：要用20mL乙醇-氨溶液（配制方法見3.4）提取2遍,，再合并提取液，濃縮至10mL。

此時洗脫液總量約40mL,，需40℃濃縮至10mL左右【相當(dāng)于除去乙醇】,。整個濃縮過程非常耗時，差不多處理一個樣要一小時,，而且終的結(jié)果回收率非常不理想,。

按照第yi次實驗的結(jié)果，小編進(jìn)行了一些優(yōu)化,，標(biāo)準(zhǔn)上是全部提取液濃縮至10mL左右后凈化,，改為移取了其中20mL經(jīng)濃縮至約5mL后上樣。

根據(jù)第二次實驗結(jié)果,，回收率已經(jīng)達(dá)到了90%-100%,，滿足了檢測的要求。

終優(yōu)化后的實驗步驟和譜圖

一,、提取

稱取樣品2g（±0.01g）于50mL離心管中,，加入20mL乙醇-氨溶液，超聲提取30min,，離心10min（4000r/min）,，吸取上清液于另一50mL離心管中；殘渣中加入20mL乙醇-氨溶液,，重復(fù)提取一次,，合并兩次上清液，混勻,，準(zhǔn)確移取20mL上清液,，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少于5mL,轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，用水定容至10mL,，待凈化,。

二、凈化

SPE柱：月旭Welchrom® NH2規(guī)格：500 mg/6mL

活化：依次用5mL甲醇,，5mL2%甲酸水溶液過柱,，棄去流出液

上樣：將待凈化液全部上樣，自然流干,，棄去流出液

淋洗：依次用5mL2%甲酸水溶液,，再用5mL甲醇淋洗小柱，棄去流出液

洗脫：用5mL10%氨水甲醇溶液,，收集于15mL試管中,，抽干小柱

濃縮：氮吹至近干，用水定容至1mL,上HPLC檢測,。

三,、儀器條件

色譜柱：月旭Ultimate®XB-C18,4.6×250mm,5μm

流動相：乙酸銨：甲醇=35:65

柱溫：35℃

進(jìn)樣量：20μL
檢測波長：484nm

流速：1.0mL/min

總結(jié)

在優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)方法的時候：

1）先選擇合適的SPE小柱,，用目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行固相萃取操作，分步排查SPE步驟,，確認(rèn)小柱與標(biāo)準(zhǔn)方法是否滿足具體要求,；

2）再按標(biāo)準(zhǔn)方法，做空白基質(zhì)加標(biāo),，確認(rèn)前處理樣品提取步驟中目標(biāo)物的損失情況,，分析造成目標(biāo)物損失的原因及步驟，有針對性優(yōu)化方法,；

3）接著做樣品和樣加標(biāo),，看目標(biāo)物回收率情況，優(yōu)化提取量或提取次數(shù),；后得出一個穩(wěn)定的方法,，保證滿足標(biāo)準(zhǔn)回收率要求進(jìn)行檢測。