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產(chǎn)品描述

間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基是一款無外源動物成分的人間充質(zhì)gan細胞培養(yǎng)基,。可應(yīng)用于人臍帶組織來源的干細胞的原代分離,、擴增與傳代培養(yǎng),，并保持其多向分化潛能。本產(chǎn)品內(nèi)毒素水平遠低于中國藥典標準,，生產(chǎn)過程遵循ISO9001 體系,并符合GMP 指導(dǎo)原則,。

間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基主要成分：氨基酸，維生素,、無機鹽,、白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白,、胰島素,、微量元素，細胞因子等,。主要用于人臍帶來源的干細胞原代分離,、擴增與傳代培養(yǎng),。

訂購信息

產(chǎn)品組分

運輸與保存

干冰運輸。組分A在4℃保存,，組分B在-20℃保存,，混合后4℃保存，有效期12個月,。

使用方法

間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基配制

1. 37℃快速解凍組分B,，快速溶解時不易破壞添加劑中營養(yǎng)物質(zhì)，時間大致為10min,。待添加劑融化后搖勻,，分裝或直接按比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝后添加劑立即儲存于-20℃至-80℃,，避免反復(fù)凍融,。

2. 將組分B以10%比例加入到組分A中，混勻,，即為間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基,。混合后培養(yǎng)基可在4℃ 穩(wěn)定儲存2-3 周,，不建議使用已配制超過3 周的培養(yǎng)基,。

3. 間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基可直接應(yīng)用于人類臍帶組織來源的干細胞的原代分離、擴增與傳代培養(yǎng),。

4. 預(yù)先高溫高壓滅菌處理剪刀,，鑷子等實驗器械。

5. 預(yù)先紫外滅菌超凈臺/安全柜等實驗環(huán)境,。

【注】以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作：

1. 間充質(zhì)干細胞原代分離（貼壁法）

臍帶簡介：臍帶包括臍帶血,、華通氏膠、兩根動脈,、一根靜脈,，所有這些結(jié)構(gòu)被臍帶上皮（內(nèi)襯膜）包裹。臍帶是間充質(zhì)干細胞的主要來源,，其中華通氏膠只含有間充質(zhì)干細胞一種干細胞,，是常用來分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的結(jié)構(gòu),。而內(nèi)襯膜則含有至少兩種干細胞：間充質(zhì)干細胞和上皮干細胞,，這兩種干細胞也是細胞治療的主要來源。以下方法為從華通氏膠中分離高純度的間充質(zhì)干細胞詳細步驟：

1.1. 無菌收集長度約10cm 的臍帶,，迅速將臍帶放到含有人臍帶脂肪保存液的50mL離心管中,。在4℃條件下快速運到實驗室，在4h 內(nèi)處理完成全部過程,。

1.2. 將臍帶置于生物安全柜中冰盒里放置的直徑10cm 培養(yǎng)皿中,。用預(yù)冷的PBS 多次清洗臍帶,，去除殘留的血液即止。以下分離組織塊的過程確保全程臍帶浸泡在預(yù)冷PBS 中保持濕潤,。

1.3. 使用剪刀徑向剖開臍帶,，將血管以及周圍的華通氏膠暴露出來。

1.4. 用解*刀將華通氏膠與血管分離,，用鑷子夾住血管,，整條剝離，中間白色部分即華通氏膠（具體人類臍帶結(jié)構(gòu)參見圖1）,。

1.5. 用剪刀將華通氏膠剪成0.5-1cm 見方的薄片組織塊,，盡量不要太厚。最后剩余的臍帶上皮（內(nèi)襯膜）組織棄除,。

注意：組織塊盡量接近片狀,，增大與培養(yǎng)皿接觸面積，提高細胞爬出率

1.6. 每個直徑10cm 的培養(yǎng)皿中放置10-15 個組織塊,，加入6mL 完培養(yǎng)基,。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同原代分離體系初始組織塊數(shù)量以及細胞爬出率見表1,。

注意：①為促進組織塊貼壁,，培養(yǎng)基不能加太多，否則組織塊容易漂起 ②為促進組織塊貼壁,，72 小時內(nèi)不能搖晃培養(yǎng)皿,，72 小時第一次換液也是同理。

表1.臍帶組織塊粘壁數(shù)據(jù)（平均數(shù)據(jù)）

1.7. 每72 小時換液,。一般5-7 d可以看見貼壁組織塊附近有細胞爬出,，12-15 d細胞匯合度達到70%以上，即可準備傳代,。

1.8. 細胞傳代時,，用槍頭吸掉組織塊以及原有培養(yǎng)基，加入5mL PBS 清洗一次,。每個直徑10mL,，的培養(yǎng)皿中加入5mL 的細胞消化液，搖勻覆蓋皿底,，37℃恒溫箱2-3min 或室溫3-5min 孵育,。

1.9. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿底，輕輕敲打皿底,，細胞呈細沙狀脫落,，加入同體積完培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細胞完脫落下來,，將細胞懸液收集到15mL 離心管中,，300×g離心5min,。

1.10. 用完培養(yǎng)基重懸、計數(shù),，此時的細胞稱為P0 代,。相關(guān)代次預(yù)期收獲細胞量請參考表2。

1.11. 根據(jù)本公司統(tǒng)計數(shù)據(jù),，10cm 長的臍帶,，約可以收獲1.24×107 個P0 代細胞，一根臍帶長度大約20cm,，約可以收獲2.5×107 個P0 代細胞,。

1.12. 根據(jù)本公司檢測，按1:8 傳代,，細胞形態(tài)在P10 代內(nèi)不發(fā)生變化,。P10 代以上細胞沒有實際應(yīng)用意義，暫不檢測,。

1.13. 臍帶兩端的組織原代分離效率有較大差異,，近胎盤端分離效率要高于近胎兒端10-30%。

表2.10cm 長的臍帶P0-P5 代預(yù)計收獲細胞數(shù)量（1:8 傳代）

2. 間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)

2.1. 在顯微鏡下觀察細胞,，細胞匯合度達到90%,，即可準備傳代;

2.2. 吸掉培養(yǎng)瓶/皿中的培養(yǎng)基，用PBS 清洗一次,，加入適量的細胞消化液（AC-1001024）覆蓋瓶/皿底,，37℃恒溫箱2-3min 或室溫3-5min 孵育。

2.3. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離瓶/皿底,，輕輕敲打瓶/皿底,，細胞呈細沙狀脫落，加入等倍體積的完培養(yǎng)基,，用移液槍扇形吹打使細胞脫落下來,，并輕輕吹打成單細胞，將細胞懸液收集到適當?shù)碾x心管中,，室溫300×g 離心5min,。

2.4. 棄上清，加入適量完培養(yǎng)基,，重懸細胞,，按照比例進行傳代或計數(shù)后按照1.1-1.45×104 個/cm2密度進行接種。均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中,，置于37℃,，5%CO2 條件下培養(yǎng)。相關(guān)數(shù)據(jù)請見表3,。

注意：細胞規(guī)模生產(chǎn)建議1:5-1:8 傳代,，一般72 小時可以達到90%以上匯合度。

表3.不同體系建議細胞接種數(shù)量及加液量

3. 人臍帶間充質(zhì)干細胞凍存

3.1. 同步驟2.1,；

3.2. 同步驟2.2,；

3.3. 同步驟2.3；

3.4. 棄上清,，用4℃保存的無血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006）重懸細胞,，取部分細胞計數(shù)。

注意：無血清細胞凍存液即拿即用,，用完之后盡快放回4℃冰箱,，以防室溫放置太久，影響質(zhì)量,。

3.5. 計數(shù)后用無血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006）調(diào)節(jié)細胞密度至建議凍存密度1-5×106個/mL,，每支凍存管（需提前做好標記）分裝1.5-2mL，直接放入-80℃冰箱快速凍存,。

3.6. -80℃放置過夜后轉(zhuǎn)移至液氮長期保存,。

4. 間充質(zhì)干細胞復(fù)蘇

4.1. 從液氮中取出凍存的hUMSC，37℃水浴快速融解,。

4.2. 在生物安全柜或超凈臺中,，先在15mL 離心管中加入5 mL 37℃預(yù)熱的完培養(yǎng)基，將解凍后的細

胞懸液緩慢滴加到離心管中,。

4.3. 300×g 離心3min,，吸掉上清，加入適量完培養(yǎng)基重懸細胞至建議接種濃度（參考表3）,。

4.4. 將細胞懸液均勻滴加到培養(yǎng)瓶/皿中,，水平十字振動培養(yǎng)瓶/皿使細胞均勻。置于37℃,，5% CO2 條

件下培養(yǎng)24 小時后觀察細胞復(fù)蘇狀態(tài),。

4.5. 細胞無異常即可同時更換新鮮的完培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

4.6. 初次換液后每48-72 h更換培養(yǎng)液直至傳代,。

注意事項

1.     本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用,，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域,。

本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用,，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域,。