Quick Cell探針法支原體檢測試劑盒

產(chǎn)品描述

Quick Cell探針法支原體檢測試劑盒（Quick Cell qPCR Mycoplasma Detection Kit with Probe）采用支原體特異性引物和支原體特異性熒光探針（報告基因為FAM），用于對樣品的支原體基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴增檢測,。試劑盒內(nèi)同時含有內(nèi)參對照質(zhì)粒mycoIC2和相應(yīng)的引物和熒光探針（報告基因為VIC）,，用于監(jiān)控支原體DNA提取和qPCR擴增的效率。本試劑盒可用于檢測一切可能含支原體的樣品,，比如：體外細(xì)胞培養(yǎng)的上清,、血清、各種體液（如唾液,、尿液,、鼻腔分泌物）、別的液體樣品,。

經(jīng)多次測試,，本試劑盒有記錄可以識別在體外細(xì)胞培養(yǎng)中曾經(jīng)報道出現(xiàn)的20種支原體。根據(jù)文獻(xiàn)報道,，這些支原體基本上占污染細(xì)胞的支原體種類的100%,。具體如下：（1）M. hyorhinis,、（2）M. fermentans、（3）M. arginini,、（4）M. hominis,、（5）M. orale、（6）M. salivarium,、（7）M.pirum,、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae,、（10）M. bovis,、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum,、（13）M. buccale,、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis,、（16）M. pulmonis,、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum,、（19）M. canis,、（20）Ureaplasma urealyticum（M.為Mycoplasma的縮寫；A.為Acholeplasma的縮寫）,。

訂購信息

產(chǎn)品組分

注：①本試劑盒由于含有內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2（用于監(jiān)控支原體DNA提取和qPCR擴增的有效性）,，客戶可以選擇進(jìn)行樣品支原體DNA的提?。▋?nèi)參質(zhì)粒mycoIC2在支原體DNA提取過程中加入），也可以選擇不進(jìn)行樣品支原體DNA的提?。▋?nèi)參質(zhì)粒mycoIC2在配制體系時加入）,。

②本試劑盒的配套儀器可以是任何具有FAM和VIC檢測通道的熒光定量PCR儀,。

運輸與保存

藍(lán)冰運輸,。-20℃避光保存，有效期60個月,。

使用方法

1.       待測樣品的前處理

為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染,，待測的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品需要取自換液后培養(yǎng)2-3d且匯合度在90%左右的細(xì)胞培養(yǎng)液上清（貼壁細(xì)胞）。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也需要在換液傳代后,，讓細(xì)胞生長2-3d再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測,。可以按照以下兩種方法之一進(jìn)行樣品的前處理：

1.1 方法一：對樣品進(jìn)行支原體DNA的提取

很多樣品（比如：培養(yǎng)很多天的細(xì)胞上清,、血清,、血漿等）由于含有抑制PCR擴增的成分,，如果樣品不進(jìn)行前處理而直接檢測，有可能導(dǎo)致qPCR擴增失?。?span>qPCR結(jié)果：支原體通道和內(nèi)參對照通道均無擴增曲線）,。該類樣品建議客戶進(jìn)行樣品DNA提取（或者離心清洗,，見后文方法二）后,，再進(jìn)行檢測。提取DNA的過程有兩個作用：(1)  基本可以去除所有抑制PCR擴增的成分,，保證后續(xù)定量PCR擴增的正常進(jìn)行,；（2）具有濃縮支原體DNA的作用，可以提高相對檢測靈敏度10-100倍,。

1.2  方法二：樣品不經(jīng)DNA提取

推薦此方法,。該方法不僅可以濃縮支原體從而提高相對檢測靈敏度，還可以去除絕大部分可能的抑制物,，PCR擴增被抑制的可能性極低,。如果該簡單一步離心清洗的方法仍然無法去除抑制物，可以使用后文注意事項部分的三步離心清洗的方法,。具體方法如下：

(1)  根據(jù)濃縮倍數(shù),，可以取100 - 1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內(nèi)，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 min,，將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一個離心管內(nèi),，丟棄細(xì)胞沉淀。

(2)  將上清繼續(xù)13000 rpm（約16000 g）高速離心10 min,，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀,，可以保留底部3-5 μL液體），用50μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存）或者去離子水（樣品比較不穩(wěn)定,，只適合當(dāng)天或短期內(nèi)檢測使用）重懸沉淀（沉淀中含有支原體）,，吹吸均勻（如果最初使用了1500 μL的樣品，則支原體濃度大約提高了30倍）,。

(3)  至此,，該樣品可以直接進(jìn)行檢測，也可以進(jìn)行熱處理后再檢測（熱處理后,，樣品保存更穩(wěn)定）,。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理5 min（可以轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，在PCR儀上進(jìn)行加熱處理）,，簡單離心（1000 g,，5 sec）后，取上清進(jìn)行檢測。

注1:這里的細(xì)胞培養(yǎng)上清不是指細(xì)胞經(jīng)胰*消化后的離心上清,，而是指至少培養(yǎng)2d后的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)液上清（不需要胰*消化,，也不能取經(jīng)胰*消化后的離心上清進(jìn)行檢測）或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液。

注2:本步驟的低速離心是為了去除哺乳動物細(xì)胞,，以排除其不必要的干擾,。所以離心力要嚴(yán)格控制在150-200 g，該離心力下,，哺乳動物細(xì)胞將被沉淀下來而支原體不會,。如果錯誤使用更高的離心力將可能導(dǎo)致支原體也被離心下來，從而導(dǎo)致假陰性,。

注3:收集的待測細(xì)胞培養(yǎng)液樣品如果不立即檢測,，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱,。樣品在-20℃至少可以保存一個月,，在-80℃可以長期保存。此外,，為了節(jié)約檢測成本,，可以將不同時間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測,。

2.       熒光定量PCR體系的配制

本步驟所有操作強烈建議使用進(jìn)口濾芯吸頭（比如Axygen濾芯吸頭）進(jìn)行操作,，以避免試劑被污染。操作之前,，請認(rèn)真看完后文的注意事項后,，再進(jìn)行操作：

將探針法溶液1P、陽性支原體DNA,、去離子水,、內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2從-20 ℃冰箱中取出，放室溫融化（也可以用手握住幫助融化）,。探針法溶液1P和探針法溶液2T開蓋之前,，請高速離心一下（5000 rpm，離心1min）,。探針法溶液2T不能在室溫長久放置（可以短時間放置5-10min）,，建議在-20 ℃冰箱直接吸取。

如果樣品總數(shù)為N（N=待測樣品數(shù)+1個陽性對照+1個陰性對照）,，待測樣品的前處理方法不同,，對應(yīng)的反應(yīng)體系也不同,，具體如下：

2.1樣品進(jìn)行DNA提取后的反應(yīng)體系

在DNA提取過程中,，必須按說明書加入內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2。如果提取時沒有加入內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2，則按照后文“樣品不經(jīng)DNA提取的反應(yīng)體系"進(jìn)行操作：

(1)  反應(yīng)體系：

表1. 樣品經(jīng)DNA提取后的反應(yīng)體系

注：總體積中多配制6%（該比例如果覺得不合適,，可以自己調(diào)整）,，是為了防止移液誤差，以保證每個反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量,。

例：如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照）,，則樣品總數(shù)為10個。探針法溶液1P的總體積為11×10×1.06=116.6 μL,，探針法溶液2T的總體積為1×10×1.06=10.6 μL。

(2)  將上述2種溶液混合，吹打均勻后,，按每管12 μL分裝到熒光定量PCR八聯(lián)管中,。

(3)  待測樣品管加入18 μL提取好的待測樣品DNA（樣品DNA加入量不能減少，否則內(nèi)參質(zhì)粒擴增可能失?。?；陰性對照管加入2 μL內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2（吹吸均勻后加入）和16 μL去離子水（為防止去離子水被污染，此處建議使用20 μL移液槍配合200 μL吸頭進(jìn)行吸取操作）,；陽性對照管加入2 μL陽性支原體DNA（吹吸均勻后加入）和16 μL去離子水,。每管反應(yīng)液的總體積為30 μL。

2.2 樣品不經(jīng)DNA提取的反應(yīng)體系：

(1)  反應(yīng)體系：

表3. 內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2統(tǒng)一在配制PCR反應(yīng)體系時加入

注：總體積中多配制6%（該比例如果覺得不合適,，可以自己調(diào)整）,，是為了防止移液誤差，以保證每個反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量,。

例：如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照）,，則樣品總數(shù)為10個。去離子水的總體積為14×10×1.06=148.4 μL,，探針法溶液1P的總體積為11×10×1.06=116.6 μL,，探針法溶液2T的總體積為1×10×1.06=10.6 μL，內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2的總體積為2×10×1.06=21.2 μL,。

(2)  將上述3種溶液混合,，吹打均勻后，按每管28  μL分裝到熒光定量PCR八聯(lián)管中,。

(3)  待測樣品管加入2 μL待測樣品DNA,，陰性對照管加入2 μL去離子水，陽性對照管加入2 μL陽性支原體DNA（吹吸均勻后加入）,。每管反應(yīng)液的總體積為30 μL,。

(4)  蓋上熒光定量PCR八聯(lián)管蓋子，去除反應(yīng)管中的大氣泡,，3000-6000 rpm離心30 sec,。

注：定量PCR八聯(lián)管的封蓋,，應(yīng)該佩戴全新的PE手套進(jìn)行操作，避免裸手接觸定量PCR八聯(lián)管,。

3.       實時熒光定量PCR擴增：

將PCR八聯(lián)管放入熒光定量PCR儀內(nèi),，設(shè)置如下實時熒光定量PCR擴增程序：

表3. 熒光定量PCR擴增程序

注：支原體檢測熒光通道選擇FAM（Reporter: FAM，Quencher: None）,；內(nèi)參對照檢測熒光通道選擇VIC（Reporter: VIC, Quencher: None）,；反應(yīng)體積（Sample Volume）為30 μL；參考熒光（Passive Reference,，只有ABI儀器需要設(shè)置）選擇None,。

4.       結(jié)果分析：

4.1 ABI StepOne Plus 熒光定量PCR儀基線和閾值設(shè)定方法

其他熒光定量PCR儀的設(shè)置大同小異，請參考各自儀器說明書進(jìn)行設(shè)置,。

(1)  基線（Baseline）的設(shè)定：可以將Auto baseline前面的√ 去掉,，然后手動設(shè)置基線的起點為2（將剛開始熒光值不穩(wěn)定的幾個循環(huán)排除在基線之外。如果起點2不合適,，可以適當(dāng)增減）,，終點為10左右。

(2)  閾值（Threshold）線的設(shè)定：不同通道的閾值應(yīng)該分別設(shè)定,。設(shè)定某個通道閾值線時,，首先選中含陰性對照的若干個樣品，去掉儀器勾選的自動Threshold線,，將其選項“√ Auto"改為“  Auto",，然后手動調(diào)整閾值線，以閾值線剛好超過正常陰性對照FAM通道擴增曲線（無規(guī)則噪音線）的最高點為準(zhǔn),。

4.2 實驗有效性判斷：

陽性對照管：其FAM通道有典型的S型擴增曲線（即指數(shù)擴增）,，其VIC通道的擴增線呈直線或者S型曲線。

陰性對照管：其FAM通道的擴增線呈直線,，其VIC通道應(yīng)該有典型的S型擴增曲線,。

如果陽性對照管、陰性對照管同時滿足上述條件,，則說明本次實驗結(jié)果有效,，否則實驗結(jié)果無效。

典型的陰性直線型擴增線和陽性S型擴增曲線如圖1所示：

圖1. 典型的陰性直線型擴增線（左）和陽性S型擴增曲線（右）

4.3 待測樣品結(jié)果判斷：

待測樣品有可能出現(xiàn)以下4種組合：

表4. 待測樣品管FAM通道和VIC通道可能組合

待測樣品管只要FAM通道有S型擴增曲線（組合1和組合2）就說明有支原體污染,。因為外加的內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2分子數(shù)極少，如果支原體含量很大時,，內(nèi)參質(zhì)粒的擴增會被抑制,，導(dǎo)致內(nèi)參VIC通道無信號（組合2）。

如果待測樣品管FAM通道呈直線,，而VIC通道有S型曲線（說明樣品的DNA提取過程和PCR擴增過程均正常）（由于提取過程中,，外加的內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2分子數(shù)較少,，作為內(nèi)參對照的VIC通道的Ct值會比較大），說明樣品無支原體,。

如果陽性對照管和陰性對照管結(jié)果正常，而待測樣品管FAM通道和VIC通道均呈直線,，說明PCR被抑制,。如果樣品是經(jīng)過提取的，最可能原因是：DNA洗脫前,，吸附膜中的乙醇沒有揮發(fā)（解決方法：洗脫前,，將吸附柱放50-65℃烘箱至少15min）。如果樣品是沒有經(jīng)過提取的,，則樣品本身含有抑制PCR的成分（解決方法：將樣品進(jìn)行DNA提取或者離心清洗）,。

注1:陽性結(jié)果需要結(jié)合擴增曲線（主要）和Ct值（次要）進(jìn)行判斷，不能只看Ct值（因熒光值的波動,，個別陰性樣品雖然擴增曲線基本呈直線,，但可能會出現(xiàn)Ct值，此類樣品不能判斷為陽性,。反之亦然：有些樣品有S型曲線,，但是因為熒光值波動，導(dǎo)致沒有Ct值,，此類樣品不能判斷為陰性）

注2:無論FAM通道,，還是VIC通道，只要其擴增曲線有明顯抬升（呈現(xiàn)S型曲線趨勢）,，即使其Ct值在35-40范圍內(nèi),，該檢測結(jié)果仍可判斷為陽性，可以報告該Ct值,。

注3:結(jié)果判斷完后,，將PCR八聯(lián)管用自封袋密閉后，進(jìn)行適當(dāng)處理,。

注意事項

1.         本產(chǎn)品主要用于細(xì)胞上清支原體污染檢測,，僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷,、治療等領(lǐng)域,。

2.         防DNA污染注意事項：

(1)  強烈建議所有操作（特別是qPCR體系配制步驟和吸取試劑盒中試劑的時候）使用濾芯吸頭進(jìn)行操作，以免試劑被污染,。

(2)  必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體,。

(3)  樣品前處理的各類吸頭、離心管,，以及吸取陽性對照DNA,、待測樣品DNA的吸頭,，務(wù)必小心處理，請將其裝入含有半瓶水的帶蓋的,、可密封的瓶子內(nèi),，全部樣品吸取完后，蓋上瓶蓋,，以防止陽性DNA的揮發(fā),，造成環(huán)境的污染，進(jìn)而造成假陽性,。整個操作過程,，最好不要說話，因為人的口腔和唾液都是帶支原體的,。

(4)  反應(yīng)后,，請勿打開反應(yīng)管的蓋子，否則有可能造成檢測環(huán)境的污染,。結(jié)果判斷完后,，將其用自封袋密閉后，進(jìn)行適當(dāng)處理,。

3.         實驗室必須嚴(yán)格分房間操作（本試劑盒建議在有窗戶,、通風(fēng)良好的普通房間內(nèi)操作，請勿在密閉的房間操作,。請勿在細(xì)胞培養(yǎng)間進(jìn)行該步驟的操作,，因為細(xì)胞培養(yǎng)間支原體污染概率很高）：

試劑配制房間1：專門進(jìn)行定量PCR體系的配制（建議該房間全部使用進(jìn)口濾芯吸頭。）

DNA提取房間2：專門進(jìn)行支原體DNA的提??；

DNA加樣房間3：專門進(jìn)行定量PCR體系配制后，添加待測樣品,、陽性對照,、陰性對照等操作；

PCR擴增房間4：進(jìn)行實時熒光PCR擴增檢測,。

注：如果房間緊張,，可以考慮將房間2、房間3合并在一個房間,，而房間1和房間4必須獨立,。各房間物品（包括移液槍）均為專用，不得交叉使用,。

4.         如果出現(xiàn)qPCR的擴增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制時（qPCR結(jié)果：支原體通道和內(nèi)參對照通道均無擴增曲線）,，可以采取以下幾種措施：

(1)  將取樣的時間提前到換液后2 d或3 d，此時細(xì)胞上清的PCR擴增抑制物相對比較少,，一般不會產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制,。據(jù)我們測試,，換液后5 d，PCR擴增抑制物就已經(jīng)大量積累,。

(2)  用PBS對待測樣品進(jìn)行離心清洗,，去除樣品中的抑制物。具體方法如下：取1 mL細(xì)胞上清,，先13000 rpm離心10 min,，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL,，再次離心,，吸走950 μL上清,；再加PBS 950 μL,，第三次離心，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀,，可以保留底部3-5 μL液體）,，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 min,，簡單離心（1000 g,，5 sec）后，取上清進(jìn)行檢測,。但是該方法有如下缺點：第一,，如果樣品支原體含量較少，離心清洗可能導(dǎo)致漏檢,，因為離心清洗過程中,，可能導(dǎo)致支原體部分丟失。第二,，個別樣品,，即使經(jīng)過上述清洗也無法去除抑制劑。

(3)  抽提細(xì)胞上清的支原體DNA后再進(jìn)行PCR鑒定,。

(4)  使用李記生物的Quick Cell支原體快速檢測試劑盒（細(xì)胞培養(yǎng)專用）（貨號：AC16L061）或者Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測試劑盒（貨號：AC16L062）進(jìn)行檢測,，經(jīng)測試，未發(fā)現(xiàn)這兩種試劑盒會被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物所抑制,。為了預(yù)防PCR的擴增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制的問題,，也可以考慮將所有待測樣品全部進(jìn)行離心清洗或者DNA提取后，再使用本試劑盒進(jìn)行檢測,。

5.         支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類,，用含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長,，培養(yǎng)數(shù)天后,，支原體密度一般較高,，可達(dá)107-9/mL，可以直接檢測,。第二類,，低溫保存的血漿、血清,、臍帶血,、胰*、抗生素,、未使用的培養(yǎng)液等樣品,，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少,，直接使用快速支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測,，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進(jìn)行離心濃縮將支原體DNA濃縮提取,，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續(xù)提高10-100倍,。該方法速度快，當(dāng)天出結(jié)果,，但是可靠性不如后面的培養(yǎng)法,。（2）使用支原體液體培養(yǎng)基（必須同時接種不含精*酸和含精*酸的兩種支原體液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)3-7 d后，再進(jìn)行檢測,。具體方法請參考李記生物Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測試劑盒（貨號：AC16L062）說明書中最后的注意事項部分,。該方法速度較慢，需要3-7 d,，但是可靠性高,。

6.         如何提高本試劑盒檢測靈敏度：如果預(yù)期待測樣品支原體含量較少（比如，低溫保存的血清,、臍帶血,、胰*、抗生素,、未使用的培養(yǎng)液,、生物制品、極個別細(xì)胞培養(yǎng)上清等）,，可以采取以下幾種措施：（1）將支原體DNA濃縮提取后再進(jìn)行檢測（提取過程還可以把所有可能的PCR抑制劑全部去除）,，大約可以將檢測靈敏度提高10-100倍。（2）對支原體進(jìn)行離心濃縮：取1 mL細(xì)胞上清,，先13000 rpm（約16000 g）離心10 min,，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 min,，簡單離心后（1000 g,，5 sec），取上清進(jìn)行檢測,。該離心濃縮過程大約可以將檢測靈敏度提高20倍,。（3）如果樣品是未經(jīng)提取的，可以通過增加反應(yīng)管中樣品DNA的加入量,，比如由原來的2 μL增加到18 μL,，如此可以提高檢測靈敏度9倍（沒有提取純化或者離心清洗的待測樣品，一般不能直接擴大待測樣品體積,，否則PCR被抑制的可能性將大幅度增加,。）

7.         如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染，推薦使用李記生物的Quick Cell支原體祛除預(yù)防試劑盒（貨號：AC16L066）,、EZ 水浴鍋抑菌劑（貨號：AC16L162）,、EZ 細(xì)胞房除菌劑（貨號：AC16L143）。產(chǎn)品詳情可咨銷或見官,。

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