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細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染來源/檢測(cè)/預(yù)防/去除

一、細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染來源及主要支原體種類

       支原體（Mycoplasma）是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間（0.1 - 0.6μm）,，沒有細(xì)胞壁,、并獨(dú)立生活原核生物，形態(tài)呈高度多形性,，呈圓形,、絲狀或梨形。由于支原體直徑較小,，進(jìn)行除菌過濾是,，約1%的支原體可以直接穿過常規(guī)的0.22μm的微孔除菌濾膜，造成細(xì)胞的支原體污染,。支原體污染的來源包括：（1）工作環(huán)境的污染,，實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染；（2）操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）,；（3）已受污染的培養(yǎng)基,、血清，或用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染,；（4）污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染,。

       目前，已發(fā)現(xiàn)的支原體品種有100多種,，但根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體,。以下13種支原體污染在全部支原體污染中所占比例超過99%,。（1）M. orale、（2）M.Arginini,、（3）M.Hyorhinis,、（4）A.Laidlawii、（5）M.Fermentans,、（6）M. salivarium,、（7）M.pirum、（8）M. hominis、（9）M. agalactiae,、（10）M.bovis,、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis,、（13）M. pulmonis,。其中尤其是前四種：M.orale（口腔支原體）、M.arginini（精氨酸支原體）,、M.hyorhinis（豬鼻支原體）和A.laidlawii（萊氏無膽甾原體）所占污染比例超過95%,，前8種占比超過98%。

二,、支原體污染對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的危害

1,、支原體污染的普遍性

       支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域遇到的性問題，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,，綜合美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）,、美國模式菌種收集中心(ATCC)等機(jī)構(gòu)收到的相關(guān)數(shù)據(jù)，世界各國細(xì)胞系支原體污染的平均比例為30-60%,。該數(shù)據(jù)未統(tǒng)計(jì)中國大陸的數(shù)據(jù),，但可以確定，大陸地區(qū)的支原體污染比例與此相當(dāng),，或更嚴(yán)重,。

表1.部分國家及機(jī)構(gòu)細(xì)胞系污染數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2、支原體污染的危害

根據(jù)已發(fā)表的支原體污染研究文獻(xiàn),，支原體污染細(xì)胞后,，幾乎能影響每一個(gè)細(xì)胞參數(shù)。

（1）支原體污染可能導(dǎo)致細(xì)胞染色體的異常和損傷,，改變細(xì)胞的代謝,、生長、形狀,、附著,。

（2）支原體影響被污染細(xì)胞的基因表達(dá)。相關(guān)研究表明,，支原體污染的細(xì)胞系與對(duì)照組比較,，有多達(dá)200個(gè)基因表達(dá)差異達(dá)2倍以上。

（3）導(dǎo)致MTT等細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果嚴(yán)重錯(cuò)誤,。支原體對(duì)MTT有額外還原作用,。

（4）支原體污染能耗盡營養(yǎng)物，促進(jìn)代謝積累,，重度支原體污染導(dǎo)致pH改變,。

（5）誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞因子表達(dá),，并改變培養(yǎng)細(xì)胞的代謝、增殖特征及形態(tài),。支原體污染可以直接影響L-arginine的代謝

（6）支原體污染可以誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟,，這對(duì)于開展人體免疫細(xì)胞的腫瘤治療的影響將是災(zāi)難性的。

3,、支原體污染的隱蔽性

      支原體大小約0.1 - 0.6微米,，體積比病毒稍大，輕度到中度的支原體污染不會(huì)明顯改變細(xì)胞培養(yǎng)液的渾濁度和pH值,，也不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)或生長速度的明顯改變,，所以科研人員很難及時(shí)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的細(xì)胞已經(jīng)被支原體污染，進(jìn)而改變了基因表達(dá)譜,，顯示虛假的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。通常情況下，如果不排除支原體污染因素,，很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往缺乏說服力,。2013年,，*期刊《Nature》明確要求,，在涉及細(xì)胞培養(yǎng)的科研工作中，必須進(jìn)行支原體檢測(cè),，并排除其影響,。

三、支原體污染檢測(cè)

1,、支原體檢測(cè)方法概述

      支原體污染嚴(yán)重干擾細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，檢測(cè)有無支原體污染的方法較多，可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室條件,、檢測(cè)方法便捷性等作出選擇,。

       ①電子顯微鏡，相差顯微境觀察,。用掃描電鏡或透射電鏡,，直觀觀察支原體形態(tài)?；蛘咴诩?xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)預(yù)置蓋玻片,，接種細(xì)胞在蓋玻片上，培養(yǎng)24小時(shí)后取出用油鏡觀察,。如有支原體,，因支原體與細(xì)胞在不同平面，可發(fā)現(xiàn)支原體呈現(xiàn)暗色顆粒裝,。缺點(diǎn)：設(shè)備要求嚴(yán)格,，檢測(cè)成本高,，不適合普通實(shí)驗(yàn)室日常常規(guī)檢測(cè)。

      ③DNA熒光染色法,，利用支原體沒有細(xì)胞膜（壁）的特性,，用熒光染料Hoechst 33258染色， Hoechst 33258能與支原體DNA結(jié)合著色,，在熒光顯微鏡下觀察,，呈現(xiàn)綠色小點(diǎn)。缺點(diǎn)：靈敏度太低,，當(dāng)檢測(cè)成陽性時(shí),，細(xì)胞經(jīng)常已經(jīng)嚴(yán)重污染。‚

  ④培養(yǎng)法,，用支原體培養(yǎng)基大量增殖支原體,，是相對(duì)可靠的支原體檢測(cè)技術(shù)。缺點(diǎn)：耗時(shí)長,，需要數(shù)周時(shí)間才能得到結(jié)果,，不適合作為細(xì)胞培養(yǎng)液中支原體污染的快速檢測(cè)。此外,，該方法不能檢測(cè)豬鼻支原體,，因?yàn)樨i鼻支原體不能在固體培養(yǎng)基上形成可見的菌落，豬鼻支原體（M.Hyorhinis）約占所有支原體污染的20-50%,。

       ⑤PCR法,，提取細(xì)胞培養(yǎng)液，提取支原體,，制備樣品,，根據(jù)支原體高度保守的16SrRNA序列設(shè)計(jì)引物（避免真核細(xì)胞或細(xì)菌DNA干擾），設(shè)置陰性,，陽性對(duì)照,，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后成像觀察，可識(shí)別已發(fā)現(xiàn)的幾乎全部100余種支原體,。

       ⑥Quick Cell快速檢測(cè)法,，拓?fù)涿腑h(huán)化支原體DNA，在根據(jù)高保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物引導(dǎo)下,，采用特殊等溫DNA擴(kuò)增酶,，61℃條件下，連續(xù)滾環(huán)式擴(kuò)增支原體DNA 60分鐘,，根據(jù)有無支原體污染,，隨著擴(kuò)增進(jìn)程可目視實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

       ⑦化學(xué)發(fā)光法,，裂解支原體后,，有底物情況下,，支原體特異性的酶，能將ADP轉(zhuǎn)化成ATP,。ATP參與熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chǎn)生光的過程,，所以可以通過催化底物熒光素導(dǎo)致的生物發(fā)光（Bioluminescence）信號(hào)來判別支原體DNA存在與否。

      綜上所述,，在多種支原體檢測(cè)方法中,，受實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)時(shí)長,、便捷性等因素限制,，①-④僅在很少情況下得到應(yīng)用。實(shí)際科研工作中,，應(yīng)用的是⑤ PCR支原體檢測(cè)法,；⑥Quick Cell快速支原體檢測(cè)法；⑦化學(xué)發(fā)光支原體檢測(cè)法,。

2,、幾種zui常用支原體檢測(cè)方法比較

3,、支原體檢測(cè)策略及方法選擇

①單個(gè)方法獨(dú)立檢測(cè)支原體（正確檢出率80%-99.9%）

      就單個(gè)檢測(cè)方法及原理而言,，“化學(xué)發(fā)光法”擁有zui高的正確檢出率（99.9%），用時(shí)zui短,，應(yīng)為方法,?？蛇x產(chǎn)品為Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (CAT:C4056L1065，價(jià)格：約9800元/100次）,，或李記生物公司的“Quick Cell 支原體發(fā)光法檢測(cè)試劑盒（CAT:C4056L1065,，價(jià)格：1250元/50次）”。

      若受實(shí)驗(yàn)室條件所限沒有配備化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀,，或多功能酶標(biāo)儀,，建議選擇“Quick Cell快速檢測(cè)法”，該方法1小時(shí)出結(jié)果,，避免了PCR法因細(xì)胞代謝產(chǎn)物抑制PCR反應(yīng)導(dǎo)致的假陰性出現(xiàn),，正確檢出率大于99%，對(duì)設(shè)備幾乎無要求,，可目測(cè)結(jié)果,。產(chǎn)品可選李記生物公司的“Quick Cell支原體快速檢測(cè)試劑盒（CAT:C4056L1060，價(jià)格：1250元/50次）”,。

②多原理支原體檢測(cè)策略

      市場(chǎng)在售的所有支原體檢測(cè)試劑盒,，目前沒有一種可以檢出全部可能的支原體污染，如果從事細(xì)胞治療,、進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng),、生產(chǎn)血清、胰酶,、培養(yǎng)液工作的科研人員,，強(qiáng)烈建議選擇兩種以上檢測(cè)方法，確保支原體正確檢出率達(dá)到100%,，避免關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)不必要的損失,。

      細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染是個(gè)普遍性問題，污染來源很多,，根據(jù)國外生物實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范做法,，實(shí)驗(yàn)室的支原體檢測(cè)要定期進(jìn)行，一般一個(gè)月做一次支原體檢測(cè),，可以*時(shí)間確定支原體污染情況,，顯著降低或避免支原體污染對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的影響。

四,、支原體污染去除

1,、支原體污染預(yù)防

      根據(jù)可能的支原體污染來源，在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，要嚴(yán)格控制環(huán)境污染,；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)器材,、耗材要保證無菌,；在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下,，可在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的特定抗生素；發(fā)現(xiàn)支原體污染后,，要清除支原體,，防微杜漸。

2,、支原體污染的去除及預(yù)防

      因?yàn)橹гw沒有細(xì)胞壁,，一般用于細(xì)胞壁合成的抗生素對(duì)支原體沒有作用，如青霉素,、萬古霉素多粘菌素（polymycin）,、利福平、磺胺藥物普遍沒什么效果,。對(duì)支原體zui有抑制活性及常用于支原體去除的抗生素是四環(huán)素類,、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮。在低濃度時(shí),，這些抗生素不會(huì)產(chǎn)生耐藥性,，且對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性較小。四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯能結(jié)合30S和50S核糖體亞基,，從而抑制支原體蛋白質(zhì)合成,，喹諾酮抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶。因此可以在細(xì)菌DNA復(fù)制及蛋白質(zhì)合成兩個(gè)層面上抑制細(xì)菌生長,，明顯增強(qiáng)除菌效果,。

3、支原體去除試劑選擇

      選擇支原體去除試劑需要注意幾個(gè)關(guān)鍵幾點(diǎn)：①細(xì)胞毒性小,，毒性大的試劑在去除支原體的同時(shí),，會(huì)殺死細(xì)胞；②支原體去除效果,，選擇廣譜試劑,，去除多種支原體,，以及細(xì)菌,，真菌等；③操作簡便,，沒有二次污染,；要考慮操作使用是否方便，因?yàn)槿绻褂闷饋肀容^麻煩,，首先是費(fèi)時(shí)費(fèi)力,，另外可能會(huì)帶來二次污染。目前市場(chǎng)上有多種支原體去除&預(yù)防試劑可選,。包括李記生物的Quick Cell支原體預(yù)防/去除試劑,，美國GenDEPOT公司的Cellmaxin,，羅氏公司的BM-Cyclin，Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3,，以及Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment 等,。

      Quick Cell支原體預(yù)防及去除試劑和Cellmaxin都是從蛋白和DNA兩個(gè)層面去除支原體，抗菌譜廣,。不同在于Quick Cell的使用者可以靈活選擇單獨(dú)或聯(lián)合使用兩種成分,，分別或同時(shí)在蛋白或DNA層面去除支原體污染，細(xì)胞毒性更小,。作用周期1-2周,，支原體去除率大于92%。去除預(yù)防兼顧

      BM-Cyclin包含泰妙菌素（BM-Cyclin 1）和二甲胺四環(huán)素（BM-Cyclin 2）兩種成分,，抑制支原體及細(xì)菌生長,，去除培養(yǎng)細(xì)胞中已感染的支原體。適用于多種培養(yǎng)細(xì)胞,，無明顯副作用,，又不影響細(xì)胞本身的代謝，而且處理過的細(xì)胞不會(huì)重新感染支原體,。BM-Cyclin需聯(lián)合使用,，作用周期2周，可消除80%以上的支原體,。不確定能否預(yù)防,。

      BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素，由真菌pleurotus mutilus 產(chǎn)生,。 BIOMYC-2基于二甲胺四環(huán)素,，四環(huán)素衍生物。此兩種抗生素溶液通常按先后聯(lián)合使用2－3次循環(huán)約一周以上,，可取得良好的效果,。BIOMYC-3 基于抗生素環(huán)丙沙星，屬于氟喹酮類,。許多支原體被證明對(duì)BIOMYC-3敏感,，需要根據(jù)支原體種類使用。處理周期2周,，能去除90%的支原體,。是否可以預(yù)防支原體目前還不能確定。

       Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是兩種抗生素的混合物,，包含兩個(gè)針對(duì)支原體的有效成分,，作用于蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制階段，對(duì)許多細(xì)菌和真核細(xì)胞則沒有影響。作用周期2周,，去除效率未知,。有兩個(gè)濃度包裝，去除用高濃度,，預(yù)防用低濃度,。