細(xì)胞骨架主要有微管(micmtuble, MT),，微絲(microfilament, MF),，中間絲(intermediate filament, IF三種類型。它們分別由不同的蛋白單體組裝而成,，其中微管蛋白(tubulin),、肌動(dòng)蛋白(actin)、波形蛋白(vimentin)等是細(xì)胞骨架的重要組成部分,，也是zui常被研究的細(xì)胞骨架蛋白,。
1963年.Slauterback采用戊二醛常溫固定方法.首先使用電鏡在水螅刺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了微管。隨后,，微絲和中間絲相繼被發(fā)現(xiàn),。它們廣泛存在于真核細(xì)胞中.細(xì)胞骨架蛋白的含量占細(xì)胞總蛋白含量的10％-30％。它們與細(xì)胞形態(tài)的維持,，細(xì)胞器的空間定位及位置改變.細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),。細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo),，免疫行為和細(xì)胞分裂等活動(dòng)有密切的關(guān)系,。
一、細(xì)胞骨架的熒光探針標(biāo)記方法
1. 微管蛋白(tubuline)的標(biāo)記
一般使用間接標(biāo)記的方法,，一抗為抗tubulin單抗,，二抗為抗小鼠IgG的熒光抗體，就可以展現(xiàn)出固定細(xì)胞,，冰凍切片的微管結(jié)構(gòu),。這種小鼠來(lái)源的單抗識(shí)別微管N端結(jié)構(gòu)域的第69-97個(gè)氨基酸殘基。同時(shí)也是用于ELISA和Western blotting的抗體,。檢測(cè)微管的其他探針有：Bis-ANS是離體狀態(tài)下微管裝配的強(qiáng)抑制劑,，熒光探針與蛋白的疏水裂隙結(jié)合，且結(jié)合后熒光強(qiáng)度增強(qiáng),。用于檢測(cè)微管蛋白時(shí)間和溫度依賴性的解聚,。DCVJ(4-(dicyanovinyl) julolidine) 用于活細(xì)胞微管蛋白裝配動(dòng)態(tài)過(guò)程的探針。它的作用可被細(xì)胞松弛素D(cytochalasin D) 所阻斷,。
2. 微絲的標(biāo)記
用鬼筆環(huán)肽(phalloidin)標(biāo)記,。鬼筆環(huán)肽是從一種菌類Amanita Dhalloides所提取出來(lái)的環(huán)肽。它與F—actin競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合,。熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽在納克水平就可與F-actin選擇性的結(jié)合并且易溶于水.為檢測(cè)組織切片.培養(yǎng)細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞體系中的actin的定位和定量提供了非常方便的標(biāo)記方法,。在肌細(xì)胞和其他細(xì)胞中鬼筆環(huán)肽與actin亞單位一比一結(jié)合。并且不與G-actin結(jié)合,。鬼筆環(huán)肽比actin的抗體標(biāo)記有*性,。首先,，在不同種類生物中它的結(jié)合性質(zhì)不發(fā)生改變。其次.鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的非特異性信號(hào)可忽略.因而圖像的反差較好,。
3. 其他細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記
抗波形蛋白(vimentin)抗體,。抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體,，抗結(jié)蛋白抗體(Anti-Desmin Antibody)等,。
二、細(xì)胞骨架的共聚焦研究技術(shù)
1. 激光共聚焦顯微鏡的工作原理
激光共聚焦顯微鏡選用單色性好,，單向性好的激光作為光源,。激光通過(guò)一個(gè)照明針孔到達(dá)樣品，樣品只被一個(gè)具有精密幾何形狀的光點(diǎn)照射在焦平面上,，只有被照射到的特定點(diǎn)所發(fā)射的熒光通過(guò)探測(cè)針孔到達(dá)檢測(cè)器.該點(diǎn)以外的任何發(fā)射熒光均被該針孔阻擋,。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛的.這就是激光掃描共焦顯微鏡系統(tǒng)中共焦的真正含義。激光共聚焦顯微鏡利用光電倍增管采集和放大信號(hào),。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將成像點(diǎn)顯示在屏幕上,，由光路中的掃描系統(tǒng)在整個(gè)樣品上掃描.在顯示器上產(chǎn)生一幅完整圖像。這幅圖像即為焦平面的共焦圖像,。只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng).將樣品新的一個(gè)層面移到共焦面上.樣品的這個(gè)新層面又成像在顯示器上,。隨著Z軸的不斷移動(dòng).就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。我們將從共聚焦顯微鏡系統(tǒng)獲得的連續(xù)光切圖像比喻為顯微CT,，從這些連續(xù)的光切圖像可通過(guò)三維重組模擬出樣品真實(shí)的立體結(jié)構(gòu),。共聚焦顯微鏡憑借其*的成像原理大大提高了分辨率，它在X-Y平面的橫向分辨率比普通的顯微鏡要高出約40％,，而且它還可以對(duì)厚樣本進(jìn)行非介入無(wú)損傷性連續(xù)光學(xué)切片,，得到三維重組的空間立體圖像。近十年來(lái),，人們已廣泛應(yīng)用CLSM來(lái)觀察和分析細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)和分子在細(xì)胞內(nèi)的分布,，觀察細(xì)胞內(nèi)離子，蛋白分子的變化,，包括細(xì)胞內(nèi)鈣,，活性氧，轉(zhuǎn)錄因子,，表面分子,，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞膜流動(dòng)性,，細(xì)胞內(nèi)分子的運(yùn)動(dòng).細(xì)胞間的縫隙連接，蛋白間的相互作用等,。共聚焦的分析研究已經(jīng)涉及了生物學(xué)的幾乎所有領(lǐng)域,。
2. 激光共聚焦的圖像采集和圖像處理與數(shù)據(jù)分析方法
將制備好的細(xì)胞放在熒光顯微鏡的載物臺(tái)上進(jìn)行觀察找到需采集的視野,，將熒光顯微鏡轉(zhuǎn)到掃描的位置。根據(jù)樣品的實(shí)際情況.在控制軟件的界面中選擇圖像采集的參數(shù),，包括激發(fā)光的波長(zhǎng),，發(fā)射光的范圍，掃描模式,，掃描速度,，探測(cè)針孔，電子放大倍數(shù)等參數(shù),。啟動(dòng)預(yù)掃,，并調(diào)節(jié)光電倍增管的電壓PMT，Z軸的位置等,，調(diào)節(jié)屏幕的圖像的細(xì)節(jié)清晰銳利,，然后采集圖像。還可設(shè)定z軸的一定范圍,。按照設(shè)定的步距進(jìn)行光學(xué)切片,。采集得到的圖像還可以通過(guò)圖像處理和數(shù)據(jù)分析得到所需要的數(shù)據(jù)和圖像。三維光切的圖像可以顯示為假三維的疊加圖.還可以用軟件實(shí)現(xiàn)三維重組得到細(xì)胞和組織的空間圖像,。
3．卵細(xì)胞紡錘體的激光共焦研究技術(shù)
以下就以家兔卵細(xì)胞的紡錘體的共焦研究為例來(lái)說(shuō)明細(xì)胞骨架共焦研究技術(shù)和方法,。
1）MII期卵母細(xì)胞紡錘體的熒光染色：卵母細(xì)胞經(jīng)以下步驟處理
a. 固定及透化液(2％甲醛+0.1％Triton X-100+1μg／ml taxol)，30min,。
b. PBS 3次,，每次15min。
c. 封閉劑(PBS+2％BSA+2％正常羊血清+2％脫脂奶+0.01％Triton X-100+0.02％疊氮鈉+0.1mol/L甘氨酸)4℃隔一晚,。
d. 鼠微管蛋白單克隆抗體(mouse monoclonal anti-a-tubulin)孵育30—60min,。
e. 封閉液沖洗3次，15-20min／次,。
f. FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育30min,， PBS洗3次。
g. 加入PI(碘化丙啶)0.5μg/ml, 10min,，PBS洗2次,。
所有步驟均在37℃下進(jìn)行。標(biāo)本使用LEICA LCSSP2 Laser Scanning Confocal Microscope LCS軟件采集和處理圖像,。
2) 圖像采集的儀器條件
物鏡采用HCX PL APO CS 63／1.32 OIL UV,。雙通道采集信號(hào)，*通道激發(fā)波長(zhǎng)為488nm,，發(fā)射波長(zhǎng)為515-535nm,。第二通道激發(fā)波長(zhǎng)為543nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590-630nm,。采集模式為xyz,，Pinhole為1.60,，z軸的總厚度為10.36mm，Z軸以1.4mm為步距連續(xù)光切,。
三,、激光共焦顯微鏡在細(xì)胞骨架研究中的優(yōu)勢(shì)
1. 分辨率高.激光共焦顯微鏡比傳統(tǒng)顯微鏡的分辨率高1.4倍。對(duì)于觀察細(xì)胞骨架等微細(xì)結(jié)構(gòu)比傳統(tǒng)熒光顯微鏡*,。共焦顯微鏡只采集到樣品焦平面的像.使細(xì)胞骨架的像更加清晰,。
2. 激光共焦顯微鏡實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的不同層面進(jìn)行掃描從而產(chǎn)生不同層面的共焦圖像。細(xì)胞骨架和細(xì)胞骨架所形成的一些結(jié)構(gòu),。如紡錘體都具有一定的空間分布.利用激光共焦顯微鏡可以對(duì)這些結(jié)構(gòu)進(jìn)行無(wú)損傷的連續(xù)三維光切,，形成他們的疊加圖像.或經(jīng)過(guò)共焦的圖像處理，三維重組得到他們的立體圖像,。這一點(diǎn)是其他的檢測(cè)方法所無(wú)法做到的,。
3. 與電鏡相比，標(biāo)本制備要簡(jiǎn)便的多,，既省時(shí)又省力,。還可以避免標(biāo)本制備過(guò)程中的假陽(yáng)性。
綜上所述.激光共焦顯微鏡因?yàn)槠?的成像原理決定了它在細(xì)胞骨架研究中的重要地位,。這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展為人類更好的認(rèn)識(shí)和研究細(xì)胞骨架的功能及其與疾病的關(guān)系提供了很好的研究手段,。
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