細(xì)胞凍存過程對保持細(xì)胞狀態(tài)影響巨大，李記生物結(jié)合多年實(shí)踐,，總結(jié)出如下實(shí)用的細(xì)胞凍存流程,。 “慢凍快融” 是細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則，這對zui大限度的保存細(xì)胞活力至關(guān)重要,。目前細(xì)胞凍存多用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作為保護(hù)劑,，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性；細(xì)胞凍存和復(fù)蘇時,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶產(chǎn)生是關(guān)鍵,。緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少冰晶對細(xì)胞的物理損傷。復(fù)蘇細(xì)胞采用快速融化的方法可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化,，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷,。
細(xì)胞凍存操作流程：
1,、細(xì)胞凍存前12~24h，換新鮮培養(yǎng)基,，使細(xì)胞一直處于對數(shù)生長期,。
2、待細(xì)胞長至80%匯合時胰酶消化,，用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細(xì)胞懸液,，1000rpm離心10min。懸浮細(xì)胞則直接離心,。
3,、棄上清，加入凍存液重懸細(xì)胞沉淀,，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107cells/mL,。將細(xì)胞懸液分至凍存管內(nèi)，每管1~1.5mL,，擰緊蓋子,。在管壁上做好標(biāo)記，標(biāo)明細(xì)胞名稱,、凍存日期等,。（細(xì)胞凍存液配方可為胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件調(diào)整）
4,、按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃放一晚→液氮保存,。也可使用程序降溫盒更為方便，細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃放一晚,，再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi),。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于zui低刻度線；凍存5次后異丙醇需要跟換一次,，以免影響凍存效果,。
5、細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇,，檢測細(xì)胞的存活率,。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長期保存，為穩(wěn)妥起見可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng),，觀察細(xì)胞生長情況,，再繼續(xù)凍存。
細(xì)胞復(fù)蘇操作流程：
1,、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱,；準(zhǔn)備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基,。
2,、將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出,，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水,，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi),，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管,，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍,，使細(xì)胞能盡快通過zui易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中,，避免引起污染,。
3、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi),，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi),，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散,，降低DMSO濃度,，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次,，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),。
4、800rpm離心5min,，棄上清,，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液,。
5,、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基,，輕輕晃動細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻,，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
6,、第二天觀察細(xì)胞貼壁生長情況,，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng),，待細(xì)胞長至80~90%匯合時正常傳代,。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn),。
對DMSO不敏感的細(xì)胞在復(fù)蘇時也可不離心,，減少操作步驟，也可降低污染的幾率。將解凍的細(xì)胞懸液直接轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi),，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基,，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng),。但培養(yǎng)12~20h后必須換新鮮的培養(yǎng)基,，移除死細(xì)胞。
注意事項(xiàng)：
1. 取細(xì)胞的過程中注意帶好防凍手套,，護(hù)目鏡,。此項(xiàng)尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮,，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升,，可導(dǎo)致爆炸。
2. 凍存液的問題：凍存液的配置已是常識,，在這里不作詳述,，但二甲基亞砜（DMSO）對細(xì)胞不是*無毒副作用，在常溫下,，二甲基亞砜對細(xì)胞的毒副作 較大,，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液*融化,。如果復(fù)蘇溫度太慢,，會造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）選擇進(jìn)口產(chǎn)品,。
3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液,。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度,，以減少對細(xì)胞的損傷,。
4. 離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),，第二天換液,。因?yàn)殡x心的目的是兩個，去除 DMSO,，去除死細(xì)胞,，這個是標(biāo)準(zhǔn)流程，但對一般人來說,，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時間,，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了,，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會受壓過大,， 死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦,。另一種說法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO）,，DMSO對細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈,，且一定倒干凈,。我在試驗(yàn)中按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇，結(jié)果無有異常,。
5. 細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時1ml細(xì)胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液,，而在我的試驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。
6. 復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：試驗(yàn)中我的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中,，分裝過多,，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁,。
7. 加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度,，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大,，就會影響 細(xì)胞生長,，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響,，還有一個說法是1％,。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。
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