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      HRM(High Resolution Melting analysis,，高分辨熔解曲線)同許多熒光PCR技術(shù)一樣,，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA雙鏈小溝中（PCR產(chǎn)物）的特性,，通過實時監(jiān)測升溫過程中dsDNA解鏈，熒光染料脫落,，熒光信號減弱或消失的過程,，高分辨記錄熔解曲線，從而對樣品進行檢測,。HRM技術(shù)利用dsDNA的物理性質(zhì),，準確反映DNA序列堿基配對特異性與解鏈溫度變化的情況，無需使用特異性標記探針,，不受突變種類和突變位點的限制,，具有高靈敏度和特異性、高通量,、操作簡單靈活,、成本低等優(yōu)點。實驗室檢測證明,，在PCR反應(yīng)前或反應(yīng)后加入飽和dsDNA染料,，對HRM分析，效果相同,。在PCR后加入,，可閉管進行HRM分析，無需凝膠電泳,。HRM分析,，不損傷PCR產(chǎn)物，用于HRM分析的PCR產(chǎn)物仍可用于電泳,、膠回收,、測序等一系列后續(xù)操作。HRM可應(yīng)用于核酸突變掃描,、基因分型,、甲基化檢測、短串聯(lián)重復(fù)序列分析,、序列匹配和RNA編輯等多方面研究,，已越來越受到國內(nèi)外核酸分子實驗室的歡迎和重視。

      對于目前絕大多數(shù)的突變分析方法來說,，都很難鑒定出純合子序列突變,。在一些不同種類的小的擴增片段中，高分辨率熔解曲線則顯示出了鑒定純合子序列突變的能力,，這種方法能鑒定出大多數(shù)的純合突變,。HRM技術(shù)在遺傳學(xué)研究方面也帶來很大便利，只需在PCR反應(yīng)體系中加入雙鏈DNA飽和熒光染料，在PCR反應(yīng)之后再花15 分鐘,，就可以完成96或384個樣品的DNA變異掃描。采用這種方法,，當片段的大小在400bp或者更小時,，靈敏性zui高。

一,、HRM分析條件

1. 設(shè)備

      PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線*取決于DNA堿基序列,，序列中如有一個堿基發(fā)生突變，都會改變dsDNA的解鏈溫度,。但是這種變化差異極小,，只有零點幾攝氏度，HRM技術(shù)需要區(qū)分Tm值差異極小的樣品,，以鑒別單個堿基的差異,，因此，對溫度分辨率的要求相當高,，如果儀器的分辨率不高,，是無法檢測的?？组g溫度差異（溫度均一性：Tm的標準偏差為0.020～0.264℃）,，孔間溫度均一性要達到0.264℃以內(nèi)才能保證HRM分析結(jié)果的準確性。熔解速率,，zui低要求0.1℃/秒,。數(shù)據(jù)密度，zui低要求10個數(shù)據(jù)點/℃,。目前市場上HRM分析儀器的供應(yīng)商,，有專門用于HRM分析的儀器，也有附帶HRM功能的Real Time PCR儀,。這些廠家包括：Roche, QIAGEN, Idaho Technology,。市場上認可度較高的一些設(shè)備包括: HR-1、LightScanner-32,、LightScanner-96和LightScanner-384(Idaho Technology Inc),，可采集55～95℃的熒光信號，變溫速率是0.02～0.1℃／s,，每秒鐘可以采集200個數(shù)據(jù)資料,。LightCycler 480s(Roche Diagnostics, Germany)和Rotor-Gene6000(Corbett)等傳統(tǒng)實時定量PCR儀加裝高分辨率熔解模塊后，采用qPCR-HRM方法可以實現(xiàn)對目的核酸片段的定量和定性檢測,。

2. 染料

      進行HRM分析的另一個必要條件是飽和染料,。用于HRM分析的染料必須滿足兩個條件。首先，必須是飽和染料,。所謂飽和染料是指染料必須能飽和結(jié)合于DNA雙鏈所有小溝位置,，也就是染料相對于dsDNA要相對過量，以使dsDNA沒有更多位置結(jié)合染料,，在dsDNA升溫解鏈時,，飽和染料從雙鏈上脫落，熒光信號同步減弱,，準確反應(yīng)出樣品熔解溫度（Tm）,、熔解曲線的不同（如圖1-A）。SYBR Green I染料廣泛用于qPCR,，但屬于非飽和染料,，不能封閉dsDNA的所有小溝位置，遠未將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和,。這樣,，DNA雙鏈高溫逐步變性時，部分熒光染料分子會隨機結(jié)合到尚未解鏈的雙鏈DNA空置的小溝位置,，染料分子發(fā)生重排,，造成熒光信號混亂，特異性下降,，不能準確反映dsDNA解鏈過程（如圖1-B）

圖1：dsDNA解鏈前后熒光染料結(jié)合情況,。A(左圖):飽和染料在dsDNA解鏈時，熒光分子同步脫落,，信號減弱,。B(右圖):不飽和染料在dsDNA解鏈時，熒光分子重新結(jié)合于未解鏈的dsDNA部位,，熒光信號沒有變化,，不能反應(yīng)樣品熔解溫度(Tm)。

       其次,，染料不能抑制PCR反應(yīng),。SYBR Green I染料不是飽和染料，加大染料濃度,，不但不能飽和結(jié)合dsDNA小溝位置,，還會抑制PCR反應(yīng)進行，造成擴增反應(yīng)無序,，混亂,。

      用于HRM分析熒光染料如LC Green, Ly Green, eva Green等均為飽和染料，能飽和結(jié)合于PCR反應(yīng)產(chǎn)物的雙鏈小溝內(nèi),，同時這些染料不會抑制PCR反應(yīng),。Ly Green為2015年推出的HRM分析染料，除具有飽和染料、不抑制PCR等特點外,，熒光信號穩(wěn)定,、實驗重復(fù)性好時期突出優(yōu)點（如圖2）。

圖2. LyGreen染料用于綿羊FecB基因HRM分析.

HRM分析設(shè)備為LightCycler@480熒光定量PCR儀(德國羅氏)

二,、HRM分析流程

1. 引物設(shè)計合成

       據(jù)基因序列應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計,、合成正向引物，反向引物（或依據(jù)參考文獻）,。將引物稀釋成10mmol/L的工作濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2. 反應(yīng)體系

注：1）50µL反應(yīng),，根據(jù)引物及擴增DNA長度不同,，可進行優(yōu)化。

2）染料在反應(yīng)前加入或反應(yīng)后加入對反應(yīng)影響不大,，反應(yīng)前加入,，可實現(xiàn)閉管操作。

3. 擴增及HRM程序

三,、HRM分析局限性及解決辦法

1. 熔解設(shè)備自身溫差,。在所有的熔解系統(tǒng)中，孔與孔之間都存在微小的溫度差異,，故影響檢測的靈敏性,。如果孔與孔間的溫度差異為0.1℃，則zui終的樣品熔解溫差也可能是0.1℃,。因此,，HRM對儀器溫度的均一性要求非常高。為解決這一問題,，可以在PCR體系中加入2種溫度內(nèi)標,，低溫時熔解和高溫時熔解。HRM儀上的分析軟件可以根據(jù)這2種內(nèi)標的熔解峰在熔解曲線中的位置來糾正孔與孔之間的溫度差異,，可顯著提高檢測的靈敏性,。

2. PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系中,，核酸模板質(zhì)量要經(jīng)過檢測,，濃度要均一。在分析多樣本時,，模板外的其他共同組分要先混合均勻后,，再分別加入樣品模板，以保證反應(yīng)體系的均一性,。若在PCR反應(yīng)后加入飽和熒光染料,，通常不需要對反應(yīng)條件做任何改變；若在PCR反應(yīng)前加入染料，可以實現(xiàn)真正的閉管操作,，避免污染,。但此時需要對原來的反應(yīng)條件做一定的改變，通常需要增加Mg2+濃度2～3 mmol/L,，增加退火溫度1～5℃,。隨著Mg2+濃度的增加，Tm值也會升高,，當Tm值超過熔解設(shè)備所允許的zui高溫度時,，還需要加入二甲基亞砜DMSO(10％)或甜菜堿(0.5 mol/L)來降低Tm值。在某些情況下,，為快速找到反應(yīng)體系zui適的退火溫度,，需要做梯度PCR試驗。在PCR反應(yīng)程序的zui后,，一定要加入解鏈和退火的步驟,，以增加PCR產(chǎn)物的雜合度，提高試驗的分辨率和準確度,。

3. 引物的二聚體,。PCR產(chǎn)物高純度的PCR特異性產(chǎn)物是獲得HRM分析結(jié)果較高特異性的前提，在PCR引物設(shè)計時,，一定要避免引物的二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu),，盡量降低基因組其他片段的非特異性結(jié)合。根據(jù)所用擴增酶的情況,，要嚴格控制PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù),，以降低非特異性擴增增加的風(fēng)險。根據(jù)試驗?zāi)康?，要嚴格控制擴增片段的長度,。試驗結(jié)果表明，隨著擴增片段長度的增加,，HRM結(jié)果的靈敏度和特異性會降低,，當擴增片段長度為400-1000 bp時，檢測的靈敏度為96.1％,，異性為99.4％,。對于一些差異只有1-2 bp的基因片段進行分型時，需要借助探針才能解決,。擴增子不能太長,，當檢測大片段如整個外顯子或內(nèi)含子的突變位點時，就要使用多對引物,，將大片段分別擴增檢測,。同其他任何基于PCR反應(yīng)的突變檢測一樣,，HRM不能檢測外顯子、內(nèi)含子或整個基因等大片段的缺失突變,。

4. 轉(zhuǎn)換純合突變子檢測,。目的片段突變或多態(tài)位點的類型在轉(zhuǎn)換、顛換,、插入和缺失4大類堿基突變類型中,，雜合突變子產(chǎn)生的Tm值差異zui大，顛換純合突變子的Tm值差異在0.8～1.4℃之間,，HRM技術(shù)可以對其準確分型,。但轉(zhuǎn)換純合突變子產(chǎn)生的Tm值差異通常小于0.4℃，HRM技術(shù)不能對其準確分型,，此時需要采用小片段法或非標記探針法,。使用小片段法時，片段長度一般設(shè)計為40～90 bp,，包含1個SNP位點為宜,。使用探針法時,，熔解曲線上會出現(xiàn)2個峰圖,，可以進行2次SNPs分析，且探針與其互補區(qū)結(jié)合形成的雙鏈部分更短,，更能增加試驗的靈敏度,，從而增加對純合突變子的分型準確性。

5. 樣品的提取方法一致,。樣品基因組提取方法樣品基因組不同的提取方法會對PCR后產(chǎn)物熔解曲線的形狀和分析結(jié)果產(chǎn)生很大的影響,，因此，待分析樣品的提取方法要一致,。為找出較為合適的提取方法,，實驗室可根據(jù)自身條件設(shè)計不同基因組提取方法對HRM結(jié)果影響的試驗，找到較為理想的提取方法或較為理想的基因組提取試劑盒,。

6. 飽和熒光染料的差異LC-Green,、Syt09、ResoLight Dye和Ly Green,等飽和熒光染料的性質(zhì)差異不大,，可以相互替代,，試驗時只需要對PCR緩沖液和反應(yīng)條件做微小的調(diào)整即可。SYBR Green I染料為非飽和熒光染料,，在檢測核酸微小變異時存在缺陷,，因此一些研究者們不建議采用。

四,、HRM技術(shù)展望

HRM技術(shù)具有高通量,、高靈敏度和特異性,、操作簡單靈活、成本低,、對DNA分子無損害,、閉管操作等諸多優(yōu)點。在畜牧業(yè)方面,，通過對畜禽基因組突變位點的關(guān)聯(lián)性分析和連鎖性分析,，HRM技術(shù)可以鑒定出更多的與畜禽特定經(jīng)濟性狀相關(guān)的SNPs位點，增加畜禽參考群育種值估計的準確性,，還可以增加畜禽分子疾病的檢出率,，并為其遺傳疾病和基因突變所致疾病的分子診斷提供革命性手段。在農(nóng)業(yè)方面,，HRM技術(shù)將增加作物遺傳標記位點的密度,，加快作物高產(chǎn)、抗逆性等優(yōu)良性狀的改良進度,。隨著消費者食品安全意識的增強和行業(yè)競爭的日趨激烈,，對食品微量成分種類和含量的檢測日益重要，HRM技術(shù)因其較高的靈敏度和特異性,，必將發(fā)展成為一種可靠便捷的檢測手段,。在人類疾病的診斷方面，HRM技術(shù)必已經(jīng)從試驗研究走向臨床診斷,，成為人類分子疾病臨床診斷的新手段,。因此，HRM技術(shù)的應(yīng)用范圍將會進一步拓寬,，并越來越受到核酸研究者的重視,。

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