細(xì)胞自噬的研究方法介紹
一、自噬誘導(dǎo)劑
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
(2) Carbamazepine/ L-690,,330/ Lithium Chloride(氯化鋰):IMPase抑制劑(即Inositol monophosphatase,,肌醇單磷酸酶)
(3) Earle's平衡鹽溶液:制造饑餓
(4) N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制劑
(5) Rapamycin:mTOR抑制劑
(6) Xestospongin B/C:IP3R阻滯劑
二,、自噬抑制劑
(1) 3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制劑
(2) Bafilomycin A1:質(zhì)子泵抑制劑
(3) Hydroxychloroquine(羥氯喹):Lysosomal lumen alkalizer(溶酶體腔堿化劑)
除了選用上述工具藥外,,一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù):包括反義RNA干擾技術(shù)(Knockdown)、突變株篩選,、外源基因?qū)氲取?/span>
三,、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè)
細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后,需對(duì)自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè),,常用的策略和技術(shù)有:
1,、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),普通光鏡下看不到,,因此,直接觀察自噬體需在透射電鏡下,。phagophore的特征為:新月狀或杯狀,雙層或多層膜,,有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體(**1)的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu),,內(nèi)含胞漿成分,,如線粒體,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等,。自噬溶酶體(**2)的特征為:?jiǎn)螌幽ぃ麧{成分已降解,。(autophagic vacuole,,**)
2,、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成
由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng),,不利于監(jiān)測(cè)(Monitoring)自噬形成,,人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時(shí),,GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí),,GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜,在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn),,一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體,,可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低,。
3,、利用Western Blot檢測(cè)LC3-II/I比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成
自噬形成時(shí),,胞漿型LC3(即LC3-I)會(huì)酶解掉一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w)膜型(即LC3-II),,因此,LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低,。
(注意:LC3抗體對(duì)LC3-II有更高的親和力,,會(huì)造成假陽性,。方法2和3需結(jié)合使用,同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響,。)
4、檢測(cè)長(zhǎng)壽蛋白的批量降解:非特異
5,、MDC(Monodansylcadaverine,單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體,,所有酸性液泡都被染色,故屬于非特異性的,。
6、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色,,但其能染所有的液泡,,故也屬于非特異性的,。
四,、自噬相關(guān)蛋白的定位
在研究自噬相關(guān)蛋白時(shí),,需對(duì)其進(jìn)行定位。由于自噬體與溶酶體,、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),、高爾基體關(guān)系密切,為了區(qū)別,,常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位:
Lamp-2:溶酶體膜蛋白,可用于監(jiān)測(cè)自噬體與溶酶體融合,。
LysoTrackerTM 探針:有紅或藍(lán)色可選,,顯示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito:載體,,轉(zhuǎn)染后表達(dá)一個(gè)融合蛋白(紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號(hào)),可用來檢測(cè)線粒體被自噬掉的程度(Mitophagy),。
MitoTraker探針:特異性顯示活的線粒體,,熒光在經(jīng)過固定后還能保留。
Hsp60:定位與線粒體基質(zhì),細(xì)胞死亡時(shí)不會(huì)被釋放,。
Calreticulin(鈣網(wǎng)織蛋白):內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔
(注意:這些蛋白均為胞漿蛋白,,爬片或胰酶消化的細(xì)胞在做免疫熒光前需先透膜(permeablize),,可采用0.1%SDS處理,。)