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細(xì)胞自噬的研究方法介紹
一、自噬誘導(dǎo)劑
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
(2) Carbamazepine/ L-690,，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositol monophosphatase,，肌醇單磷酸酶）
(3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑
(5) Rapamycin：mTOR抑制劑
(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
二,、自噬抑制劑
(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑
(2) Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑
(3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）
除了選用上述工具藥外,，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù)：包括反義RNA干擾技術(shù)（Knockdown）、突變株篩選,、外源基因?qū)氲取?/span>
三,、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè)
細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后，需對(duì)自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè),，常用的策略和技術(shù)有：
1,、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到,，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下,。phagophore的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜,，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體（**1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu),，內(nèi)含胞漿成分,，如線粒體,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等,。自噬溶酶體（**2）的特征為：?jiǎn)螌幽ぃ麧{成分已降解,。（autophagic vacuole,，**）
2,、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成
由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng),，不利于監(jiān)測(cè)（Monitoring）自噬形成,，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時(shí),，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí),，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn),，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體,，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低,。
3,、利用Western Blot檢測(cè)LC3-II/I比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成
自噬形成時(shí),，胞漿型LC3（即LC3-I）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II）,，因此，LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低,。
（注意：LC3抗體對(duì)LC3-II有更高的親和力,，會(huì)造成假陽性,。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響,。）
4、檢測(cè)長(zhǎng)壽蛋白的批量降解：非特異
5,、MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺）染色：包括自噬體,，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的,。
6、CellTrackerTM Green染色：主要用于雙染色,，但其能染所有的液泡,，故也屬于非特異性的,。
四,、自噬相關(guān)蛋白的定位
在研究自噬相關(guān)蛋白時(shí),，需對(duì)其進(jìn)行定位。由于自噬體與溶酶體,、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),、高爾基體關(guān)系密切，為了區(qū)別,，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：
Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測(cè)自噬體與溶酶體融合,。
LysoTrackerTM 探針：有紅或藍(lán)色可選,，顯示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：載體,，轉(zhuǎn)染后表達(dá)一個(gè)融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號(hào)），可用來檢測(cè)線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）,。
MitoTraker探針：特異性顯示活的線粒體,，熒光在經(jīng)過固定后還能保留。
Hsp60：定位與線粒體基質(zhì)，細(xì)胞死亡時(shí)不會(huì)被釋放,。
Calreticulin（鈣網(wǎng)織蛋白）：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔
（注意：這些蛋白均為胞漿蛋白,，爬片或胰酶消化的細(xì)胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize）,，可采用0.1%SDS處理,。）