細胞自噬的研究方法介紹
一,、自噬誘導劑
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模擬內質網(wǎng)應激
(2) Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化鋰):IMPase抑制劑(即Inositol monophosphatase,,肌醇單磷酸酶)
(3) Earle's平衡鹽溶液:制造饑餓
(4) N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制劑
(5) Rapamycin:mTOR抑制劑
(6) Xestospongin B/C:IP3R阻滯劑
二、自噬抑制劑
(1) 3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制劑
(2) Bafilomycin A1:質子泵抑制劑
(3) Hydroxychloroquine(羥氯喹):Lysosomal lumen alkalizer(溶酶體腔堿化劑)
除了選用上述工具藥外,,一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預:包括反義RNA干擾技術(Knockdown),、突變株篩選、外源基因導入等,。
三,、自噬過程進行觀察和檢測
細胞經(jīng)誘導或抑制后,需對自噬過程進行觀察和檢測,,常用的策略和技術有:
1,、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結構,普通光鏡下看不到,,因此,,直接觀察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為:新月狀或杯狀,,雙層或多層膜,,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(**1)的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構,,內含胞漿成分,,如線粒體、內質網(wǎng),、核糖體等,。自噬溶酶體(**2)的特征為:單層膜,胞漿成分已降解,。(autophagic vacuole,,**)
2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成
由于電鏡耗時長,,不利于監(jiān)測(Monitoring)自噬形成,,人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術。無自噬時,,GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中,;自噬形成時,GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜,在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點,,一個斑點相當于一個自噬體,,可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。
3,、利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成
自噬形成時,,胞漿型LC3(即LC3-I)會酶解掉一小段多肽,轉變?yōu)椋ㄗ允审w)膜型(即LC3-II),,因此,,LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。
(注意:LC3抗體對LC3-II有更高的親和力,,會造成假陽性,。方法2和3需結合使用,同時需考慮溶酶體活性的影響,。)
4,、檢測長壽蛋白的批量降解:非特異
5、MDC(Monodansylcadaverine,,單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體,,所有酸性液泡都被染色,故屬于非特異性的,。
6,、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色,但其能染所有的液泡,,故也屬于非特異性的,。
四、自噬相關蛋白的定位
在研究自噬相關蛋白時,,需對其進行定位,。由于自噬體與溶酶體、線粒體,、內質網(wǎng),、高爾基體關系密切,為了區(qū)別,,常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位:
Lamp-2:溶酶體膜蛋白,,可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合。
LysoTrackerTM 探針:有紅或藍色可選,,顯示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito:載體,,轉染后表達一個融合蛋白(紅色熒光蛋白+線粒體基質定位信號),,可用來檢測線粒體被自噬掉的程度(Mitophagy)。
MitoTraker探針:特異性顯示活的線粒體,熒光在經(jīng)過固定后還能保留,。
Hsp60:定位與線粒體基質,,細胞死亡時不會被釋放。
Calreticulin(鈣網(wǎng)織蛋白):內質網(wǎng)腔
(注意:這些蛋白均為胞漿蛋白,,爬片或胰酶消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜(permeablize),,可采用0.1%SDS處理。)