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1 、熒光免疫測(cè)定技術(shù)的概念：將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記,，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后,，測(cè)定復(fù)合物中的熒光素，這種免疫技術(shù),，稱(chēng)為免疫熒光素技術(shù),。
2、熒光的產(chǎn)生：
物質(zhì)吸收外界能量而進(jìn)入激發(fā)狀態(tài),，在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以電磁輻射的形式釋放,，即發(fā)光，這種光稱(chēng)為熒光,。這種物質(zhì),，稱(chēng)為熒光素。
由光激發(fā)所引起的熒光,，為光致熒光
------熒光免疫技術(shù)
由化學(xué)反應(yīng)所引起的熒光,，為化學(xué)熒光
------化學(xué)發(fā)光技術(shù)
3、熒光素的熒光特性：
⑴ 停止供能,，熒光現(xiàn)象隨即終止
⑵ 對(duì)光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性,綠色熒光選藍(lán)色為激發(fā)光,，紅色熒光選綠色為激發(fā)光
入射光波長(zhǎng)<發(fā)射光波長(zhǎng)
⑶ 熒光效率： 發(fā)射熒光的光量子數(shù)
熒光效率=----------------------------
吸收光的光量子數(shù)
⑷ 熒光猝滅現(xiàn)象：熒光素的輻射能力減弱
常見(jiàn)熒光素的特性：
⑴ FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光（藍(lán)色激發(fā)光）：490~495nm,，
發(fā)射光：520~530nm,，明亮的黃綠色熒光。
4,、熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般為四級(jí),，即“—”無(wú)或可見(jiàn)微弱自發(fā)熒光。“+”僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光,。“++”可見(jiàn)有明亮的熒光,。“+++”可見(jiàn)耀眼的熒光。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上,，而各種對(duì)照顯示為（±）或（-）,，即可判定為陽(yáng)性。
5,、普通熒光顯微鏡的操作指南
（1）關(guān)閉房間內(nèi)的電燈,，開(kāi)啟顯微鏡汞燈。為延長(zhǎng)汞燈的使用壽命,，汞燈開(kāi)啟不到15-30分鐘的請(qǐng)?jiān)?5-30分鐘后關(guān)閉汞燈,。再次打開(kāi)汞燈電源的間隔時(shí)間也應(yīng)該在15-30分鐘以上，避免反復(fù)開(kāi)關(guān),。
（2）根據(jù)樣品熒光素選擇相應(yīng)熒光組件,。使用減光片對(duì)熒光強(qiáng)度適當(dāng)調(diào)整（因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度不可調(diào),，所以只能使用各種減光片來(lái)調(diào)整觀察效果）
（3）選擇濾光片。常用的有綠,、藍(lán),、紫、紫外等,，分別對(duì)應(yīng)不同的激發(fā)光波長(zhǎng),。
（4）放好染色切片，找到合適的視野,。在熒光狀態(tài)下觀察標(biāo)本,，標(biāo)本內(nèi)的熒光會(huì)較快的衰減，所以要避免長(zhǎng)時(shí)間的在熒光下觀察,，可以先在明場(chǎng)下調(diào)整好要觀察的位置再使用熒光,。
（5）需拍照先確認(rèn)照相機(jī)已裝好。
（6）使用結(jié)束關(guān)閉所有電源并做好使用記錄,。
（7）如需詳細(xì)說(shuō)明,，請(qǐng)借閱說(shuō)明書(shū)。
操作流程（SABC- FITC）三步發(fā)光法
細(xì)胞爬片
蓋玻片的處理：先用洗潔精沖洗干凈（用大號(hào)的培養(yǎng)皿,，將玻片平鋪在上面,，把洗潔精弄出泡泡，放在水平搖床上搖30min~60min）→用自來(lái)水沖洗干凈（先放在水上沖,，再加上自來(lái)水在搖床上搖約30min×3次）→將濃硫酸加入培養(yǎng)皿中，泡酸24 h→自來(lái)水沖洗干凈→ddH2O沖洗30~50min×3次→放入60℃烤箱烤干→用紗布將玻片平攤開(kāi)來(lái),，隔層包裹→置于飯盒中高溫高壓消毒
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細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn),，0.25%胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù),，接種至6孔板,，每孔約3ml細(xì)胞懸液，加完后在邊上輕輕吹幾下,，十字形晃動(dòng)數(shù)次,，保證細(xì)胞在蓋玻片上均勻覆蓋。（注意：1,、預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí),，摸一個(gè)的細(xì)胞量，一般3~5×105為宜,；2,、先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，然后放玻片,，防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起,，造成雙層細(xì)胞貼片。3,、整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作,。）
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培養(yǎng)24h，待細(xì)胞接近60%~70%匯合
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取出六孔板,，浸入0.01MPBS,，約3ml/孔，于搖床上搖5min×3次
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固定：
4%多聚甲醛固定30min（室溫）,，約2ml/孔
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棄干凈液體,，（用吸管在邊緣處輕輕吹打幾次）浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次
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破膜：
加0.1%TritonX-100，20min,，室溫,，約2ml/孔
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棄干凈液體，（用吸管在邊緣處輕輕吹打幾次）浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次
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消除非特異性反應(yīng)：
浸入0.75%H2O2,，在37℃作用30min(配方：1ml30%H2O2+39ml 0.01M PBS,現(xiàn)用現(xiàn)配,，避光保存)
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棄干凈液體，浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次
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以下操作均在濕盒中進(jìn)行
封閉：
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滴加用0.01M PBS1:10稀釋的正常血清封閉液,，37℃,30min(注意：150ul/孔,；吸去多余的液體，不要洗)
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免疫反應(yīng)：
滴加0.01M PBS按一定比例稀釋的一抗,，150ul/孔（稀釋度,，一般取推薦濃度的中間值），37℃,30min后,，4℃過(guò)夜
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復(fù)溫,，室溫放置30~45min,(用or不用37℃放置10~20 min)【一抗孵育，總時(shí)長(zhǎng)在16~18h】
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棄干凈液體,，浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次
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滴加0.01M PBS 1:100稀釋的生物素化二抗,，150ul/孔，37℃,30min
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棄干凈液體,，浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次
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發(fā)光：(此操作一定要避光,，可以將搖床拿入暗室當(dāng)中，)
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滴加0.01M PBS 1:100稀釋的SABC-FITC,，150ul/孔,，37℃,30min
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棄干凈液體，浸入0.01MPBS,，5min×3~4次（一定要洗干凈,，否則背景會(huì)很高）
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取玻片時(shí)由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大,，將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出就可以了
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緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察
注意事項(xiàng)：
1,、在六孔板間隙的孔中加入0.01M PBS,，制成濕盒環(huán)境。
2,、需設(shè)空白對(duì)照,。從加一抗開(kāi)始，空白對(duì)照組全部用0.01M PBS,。
3,、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h,，時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ,，會(huì)使熒光減弱。
4,、需在操作的各個(gè)步驟中,，始終保持濕潤(rùn)，避免干燥,。
5,、所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,，避免因放置不平使液體流失,，從而造成非特異性熒光染色。
試劑配制：
1,、0.01M PBS 1000ml 2000ml 5000ml
NaCl 8.5g 17.0g 42.5g
NaH2PO4.2H2O 0.3g 0.6g 1.5g
Na2HPO4.12H2O 2.9g 5.8g 14.5g
2,、0.1%TritonX-100
TritonX-100 100ul 定容至 常溫保存?zhèn)溆?/span>
0.01M PBS 100ml 100ml
3、4%多聚甲醛
多聚甲醛 4g 60℃約5min+2滴2mol/L 搖晃 ,，定容至100ml
0.01M PBS 100ml NaOH助溶 PH=7.2 4℃保存，2周用完
4,、0.75% H2O2
30% H2O2 1ml 現(xiàn)用現(xiàn)配,，
0.01M PBS 39ml 4℃避光保存
