BD品牌 流式抗體細胞亞群研究試劑 human篇

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BD Pharmingen流式實驗方案試劑精選

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常用Human Panel：

BD公司™ CompBeads可以作為替代物來評估熒光溢出（補償）。當(dāng)熒光色素結(jié)合抗體與復(fù)合珠結(jié)合時,，它們具有與細胞非常相似的光譜特性,。然而，對于某些熒光色素,，與細胞相比光譜發(fā)射可能存在微小差異,，從而導(dǎo)致溢出值與生物控制相比有所不同。強烈建議用戶在*使用試劑時,，比較細胞溢出和Comp珠,，以確保BD Comp珠適合您的特定細胞應(yīng)用。

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為獲得jia結(jié)果,，建議在抗體染色后進行兩次清洗,。在流式細胞儀上采集細胞之前，可制備細胞,，用抗體染色,，并用洗滌緩沖液洗滌兩次，以進行免疫熒光染色,。執(zhí)行少于建議的清洗步驟可能導(dǎo)致陰性人群的傳播增加。

為了獲得jia和可重復(fù)的結(jié)果,，在同一實驗中使用兩種或兩種以上的BD-Horizon亮色染料時,，應(yīng)使用BD-Horizon亮色緩沖液。熒光染料相互作用可能導(dǎo)致染色偽影,，從而影響數(shù)據(jù)解釋,。BD-Horizon亮斑緩沖液的設(shè)計是為了小化這些相互作用。更多信息可以在BD Horizon Brilliant染色緩沖液（Cat）的技術(shù)數(shù)據(jù)表中找到,。

此篇為您提供流式抗體細胞亞群研究試劑 human篇,，用于人體細胞亞群的研究試劑

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   流式細胞技術(shù)
流式細胞術(shù)工作原理是在細胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細胞或其他生物粒子進行多參數(shù),、快速的定量分析,。它可以高速分析上萬個細胞,，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，具有速度快,、精度高,、準確性好的優(yōu)點，是當(dāng)代xian進的細胞定量分析技術(shù)之一,。
光源,、液流通路、信號檢測傳輸和數(shù)據(jù)的分析系統(tǒng)是流式細胞儀的主要組成,。目前臨床中運用流式細胞儀進行外周血白細胞,、骨髓細胞以及腫瘤細胞等的檢測是臨床檢測的重要組成部分。流式細胞技術(shù)（flow cytometry,，F(xiàn)CM）是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術(shù),。流式細胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計算機科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物,。1.使各種液體和懸浮細胞樣本新鮮,，盡快完成樣本制備和檢測；2.針對不同的細胞樣本進行適當(dāng)洗滌,、酶消化或EDTA處理,，以清除雜質(zhì)，使粘附的細胞彼此分離而形成單細胞狀態(tài),；3.對新鮮實體瘤組織可選用或聯(lián)用酶消化法,，機械打散法和化學(xué)分散法來獲得足夠數(shù)量的單細胞懸液；4.對石蠟包埋組織應(yīng)先切成若干40-50um厚的蠟片,，經(jīng)二甲苯脫蠟到水后,，再用前述方法制備單細胞懸液；5.單細胞懸液的細胞數(shù)不應(yīng)少于10000個,。
流式細胞技術(shù)的應(yīng)用：
1.其測定細胞內(nèi)DNA的變異系數(shù)小,，一般在2%以下；
2.能準確地進行DNA倍體分析,；
3.借助于熒光染料進行細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的定量研究,；
4.快速進行細胞分選和細胞收集；
5.醫(yī)學(xué)應(yīng)用：免疫功能研究各種干細胞的檢測,，癌癥病人的多藥耐藥性,，細胞功能及代謝動力學(xué)研究，血小板分析（心血管疾?。?，流式細胞術(shù)與分子生物學(xué)研究；
6 應(yīng)用于外周血內(nèi)皮細胞測定,、調(diào)節(jié)性T細胞等領(lǐng)域,。用于臨床
流式細胞分析儀臨床用于細胞治療中心在FACSVantage革命化的細胞分選功能基礎(chǔ)上推出的分選增強（Sort Enhanced edition,，SE），BD FACSVantage SE,，其新功能和新配置通過與標準多激光多熒光系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的完-美整合,，速度更快，功能更強,，是當(dāng)今流式技術(shù)的體現(xiàn),。
當(dāng)前，臨床流式細胞分析已成為檢驗醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個熱點,，其發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面,。
一．從相對細胞計數(shù)到細胞計數(shù)
流式細胞分析大的優(yōu)點是對混合細胞群體中亞群細胞的計數(shù)，如淋巴細胞可依其表面標志的不同分為T淋巴細胞（CD3+）,、B淋巴細胞（CD19+）,、NK細胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴細胞又可進一步分為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD3+CD4-CD8+）等,。這些亞群細胞計數(shù)過去多以相對百分比表達結(jié)果,，由于百分比只能代表每種細胞在混合細胞群體中所占的比例，并不能體現(xiàn)其在單位體積血液中的數(shù)量,，而對艾滋病等一些疾病的臨床診斷,，有時需要考慮細胞的數(shù)量，如患者血液中T輔助/誘導(dǎo)細胞（CD3+CD4+CD8-）的數(shù)量<200個>200個/μL,。T淋巴細胞亞群的計數(shù)在國外實驗室早已成為常規(guī)檢查,，但在國內(nèi)僅有少數(shù)實驗室開展?？梢灶A(yù)見,，隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展，對造血干細胞等的數(shù)量分析,，不久的將來,，也將作為常規(guī)檢查項目，走出實驗室進入臨床,。
流式細胞計數(shù)在臨床可開展的項目包括：①淋巴細胞亞群,，尤其是T淋巴細胞亞群的計數(shù)。②外周血或骨髓中造血干/祖細胞的計數(shù),。③血液中網(wǎng)織紅細胞的計數(shù),。④血液中血小板數(shù)量,，尤其是血小板減少癥患者血小板的計數(shù),，此種計數(shù)優(yōu)于血細胞-分析儀法，已成為血小板計數(shù)的推薦參考方法,。此外,，可能出現(xiàn)在血液中的其它一些稀少細胞（如內(nèi)皮細胞,、轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞等）的計數(shù)，也將發(fā)展為流式細胞計數(shù),。流式細胞計數(shù)的開展對臨床疾病的診斷,、治療等有重要意義。
二．從相對定量到定量分析
細胞的多種成分如某些抗原或受體表達的流式細胞分析,，以前多以平均熒光強度（MFI）或相對熒光強度（RFI）表達其含量,。由于流式細胞儀每次的儀器狀況可出現(xiàn)差異，每個實驗室所用儀器的類型也不盡相同,，因此,，以MFI或RFI表示細胞抗原或受體的表達量缺乏可比性，雖然流式細胞儀有*的熒光靈敏度,，但卻無法準確應(yīng)用這些信息,。近年來，為了通過FCM精確定量分析細胞的某些成分,，定量流式細胞術(shù)（Quantitative Flow Cytometry,，QFCM）逐漸得到發(fā)展，其定量分析原理主要有兩種：①定量抗體微球法：在特制的微球上包被已知分子數(shù)的羊抗鼠IgG分子,，再將包被不同分子數(shù)的微球混合,，形成含不同羊抗鼠IgG分子數(shù)的混合微球，此微球與待測標本在相同條件下與熒光素標記的單克隆抗體（McAb）反應(yīng)后在流式細胞儀上測定其熒光強度,，根據(jù)微球上所包被的羊抗鼠IgG分子數(shù)和與之對應(yīng)的對數(shù)熒光強度計算回歸方程,，再將待測樣本中陽性細胞的對數(shù)熒光強度代入方程即可求得其每個細胞上的平均抗原分子數(shù)（抗原結(jié)合位點數(shù)）。②定量熒光素分子微球法：在特制的微球上直接包被熒光素分子,，再將包被不同分子數(shù)的微球混合,，形成含不同數(shù)量熒光素分子的混合微球。在流式細胞儀儀器設(shè)置相同的條件下測定此微球及待測細胞的熒光強度,，根據(jù)微球上所包被的熒光素分子數(shù)和與之對應(yīng)的對數(shù)熒光強度計算回歸方程,，再將待測樣本陽性細胞的對數(shù)熒光強度代入方程，可求得每個細胞上的平均熒光素分子數(shù),，根據(jù)用于樣本測定的單克隆抗體（McAb）與熒光素結(jié)合的分子比例,，計算每個細胞上的平均抗原分子數(shù)。單細胞的抗原或受體定量是流式細胞分析的重要進展,，為細胞的生物學(xué),、分子生物學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)等研究提供了更精確的方法,。例如,，白血病原始細胞膜的CD45分子表達量低于正常淋巴細胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子數(shù)顯著高于靜止血小板,，活化淋巴細胞的CD69分子數(shù)顯著增高,，活化中性粒細胞膜CD64分子數(shù)顯著高于靜止中性粒細胞，強直性脊柱炎患者T淋巴細胞膜HLA-B27分子數(shù)明顯增高,。CD8+T淋巴細胞膜的CD38分子數(shù)增高是慢性HIV感染者病情發(fā)展或死亡的更有力的預(yù)后指標,；AIDS治療有效后，CD8+T淋巴細胞CD38分子數(shù)顯著降低,。
三．從單色到多色熒光分析
流式細胞分析已從初的間接免疫熒光染色,、單色或雙色直接熒光染色，迅速發(fā)展到三色,、四色甚至五色或六色熒光分析,，使得對細胞亞群的識別和分選、細胞功能評價等更為精確,。目前,，淋巴細胞亞群的分析、白血病免疫表型分析,，均應(yīng)使用至少三色以上的熒光分析才更可靠,。例如：輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞四色熒光分析的免疫表型為CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴細胞白血病的異常淋巴細胞的四色免疫表型為CD5+CD10—CD19+CD45+,。多色熒光分析是流式細胞技術(shù)發(fā)展的必然趨勢,，有條件時應(yīng)盡可能地采用。
四．從細胞膜成份到細胞內(nèi)成份分析
細胞膜免疫表型分析是重要的流式分析內(nèi)容之一,，很多細胞亞群的檢測和分選均是以細胞膜的免疫表型特征為依據(jù),，如T、B淋巴細胞和NK細胞分析,、白血病免疫分型等,。然而，僅有膜免疫表型的分析是不夠的,，尤其對一些細胞的系列鑒定和功能狀態(tài)分析常常較為困難,，而細胞漿或細胞核內(nèi)成份的分析則更能反映某些細胞的系列特征和功能變化。隨著近年來細胞內(nèi)成分檢測技術(shù)的不斷完善,，細胞內(nèi)成分檢測已成為流式細胞分析的又一個熱點,。例如，急性髓系白血病性原始細胞漿中檢測到髓過氧化物酶（MPO）是zui為準確的系列標志,，急性B淋巴細胞白血病性原始細胞胞漿中檢測到CD79a是zui為特異的系列標志,；檢測T淋巴細胞胞漿內(nèi)細胞因子合成的種類及含量和膜CD69分子表達，是判斷T淋巴細胞活化及其功能的重要手段,，而且還能將輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞（Th）進一步分成Th1和Th2亞類,，在Th1和Th2細胞漿中可分別合成γ-干擾素（IFN-γ）,、白細胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5,、IL-10。通過細胞內(nèi)成分檢測技術(shù)與多色免疫熒光分析方法相結(jié)合,，可檢測不同細胞亞群合成的不同細胞因子（Cytokine）,，如用五色疫熒光分析血液中淋巴細胞經(jīng)誘導(dǎo)劑刺激后，輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞亞類—Th1細胞內(nèi)有細胞因子合成的免疫表型為CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+,。
五．液體中可溶性成分的流式細胞分析
從傳統(tǒng)意義上講,，流式細胞技術(shù)只能分析細胞及其成分，液體中的可溶性成分則不能進行分析,。然而,，如果將液體中的可溶性成分結(jié)合在一種類似于細胞大小的顆粒（如乳膠顆粒）上，流式細胞儀便可以對其進行分析,，這就是近年來發(fā)展起來的流式微球分析（Cytometric Bead Assay,，CBA）技術(shù)。CBA的原理是將包被某種抗原或抗體不同大小的微球與待測液體中的相應(yīng)成分反應(yīng)形成抗原與抗體的復(fù)合物,，再加入熒光素標記的第二抗體,，微球上結(jié)合的待測抗原或抗體分子數(shù)量與其熒光強度呈線性關(guān)系，由此可對待測液體中與微球上包被抗原或抗體分子相對應(yīng)的成分進行定性或定量分析,，例如同時測定血清或細胞培養(yǎng)液中的多種細胞因子,，同時測定血清中多種自身抗體。CBA發(fā)展的時間雖很短,，目前所能檢測的項目還不多,，但其發(fā)展?jié)摿Σ蝗莺鲆暋Ｒ阎獧z測細胞因子的方法有多種,，包括靶細胞功能分析法,、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、斑點酶免疫分析（Elispots）等,，但CBA與之相比,，其靈敏度*、可達2pg/ml,，而且能同時測定單個標本中的多種細胞因子,。
六．分子表型分析
分子表型分析（Molecular Phenotyping）是指用流式細胞技術(shù)檢測細胞中特異性核酸序列或特異性基因異常。流式分子表型分析與免疫表型分析技術(shù)相結(jié)合,，為所選擇細胞亞群的特異性核酸序列（如癌gene,、病毒核酸等）檢測提供了一種非常有用的工具，具有廣闊的應(yīng)用前景,。流式分子表型與免疫表型分析結(jié)合的基本技術(shù)路線是：①待測細胞首先與特異性細胞亞群的單克隆抗體反應(yīng),，②固定并滲透細胞,，③通過PCR進行引物特異的核酸序列擴增，④應(yīng)用對擴增產(chǎn)物的特異性寡核苷酸熒光素標記探針進行熒光原位雜交（FISH）,，⑤加入針對細胞亞群單抗的熒光素標記的第二抗體,。⑥流式細胞儀檢測及數(shù)據(jù)分析。例如,，流式細胞免疫表型與聚合酶鏈反應(yīng)及熒光原位雜交（PCR-FISH）結(jié)合測定血液CD4+細胞中HIV特異的DNA或RNA,，對于AIDS的病程監(jiān)測、治療反應(yīng)以及預(yù)后等具有重要價值,。
流式熒光原位雜交（Flow-FISH）法可測定染色體端粒長度,。細胞的染色體端粒是由2~20Kb串聯(lián)的短片段重復(fù)序列(TTAGGG)n和一些結(jié)合蛋白組成，端粒長度越長,，所含重復(fù)堿基數(shù)目越多,；用熒光素標記的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特異性探針進行FISH后，端粒的長短可以流式細胞儀檢測到的熒光強度的高低反映出來,；Flow-FISH測定精度可小于3Kb的端粒長度差,，對腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、治療與預(yù)后等的研究有一定價值,。

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