 |
上海嘉鵬
主營產(chǎn)品： 超微量分光光度計,核酸蛋白檢測儀,超微量紫外分光光度計,nano光度計,超微量核酸蛋白檢測儀 |
11
聯(lián)系電話
|
上海嘉鵬
主營產(chǎn)品： 超微量分光光度計,核酸蛋白檢測儀,超微量紫外分光光度計,nano光度計,超微量核酸蛋白檢測儀 |
聯(lián)系電話
2019-2-25 閱讀(2500)
凝膠過濾層析（gel filtration chromatography）法又稱排阻層析或分子篩方法,，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀,，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì),，多是交聯(lián)的聚糖類物質(zhì),，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進行分離。
實驗方法
蛋白質(zhì)的凝膠過濾分離
實驗材料 蛋白質(zhì)
試劑,、試劑盒 凝膠過濾緩沖液
儀器,、耗材 布氏漏斗 凝膠過濾層析柱 分光光度計
實驗步驟
1. 如果凝膠過濾的介質(zhì)是干粉，則需在凝膠過濾緩沖液中*溶脹,。
2. 在遠離過往通道及直接光照的恒溫環(huán)境,，將層折柱垂直安裝在穩(wěn)固的實驗室支架上。
3. 用一注射器將凝膠過濾緩沖液從柱子的輸出管注入柱子,，至緩沖液達到柱子支持體平面之上,，注射器留在輸出端以堵住柱子。
4. 沿著一根順柱子內(nèi)壁而放的玻璃棒將凝膠混懸物倒入柱子至所設高度,，再小心往凝膠頂部加入1 cm 高的一層緩沖液,，并連接緩沖液貯存容器，取去堵著柱子輸出管的注射器,，用2~3倍柱床體積的緩沖液請洗柱子,。
5. 流盡柱子凝膠頂部上面的緩沖液,、關閉其輸出管。
6. 加入相當于柱床體積1%~5%的蛋白質(zhì)樣品,。開放輸出管,，讓樣品流進柱床，凝膠上面的柱子內(nèi)壁以緩沖液沖洗,。
7. 在凝膠頂上用吸管加入1 cm 高的緩沖液層,，重新與緩沖液貯存容器連接，開始洗脫,。
8. 分部收集流出液,。每分部相當于1%總柱床體積，分別測每個分部的A280,，并各取小份樣品測生物活性,，選出有活性的分部用SDS-PAGE檢測所含蛋白質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量，合并含目標蛋白的分部,。
9. 用2~3個柱床體積的凝膠過濾緩沖液洗柱,，柱子保存在含0.02%疊氮鈉的緩沖液中，柱于可無限次地使用,。
收起
注意事項 切勿用磁力攪拌器攪拌,，讓凝膠顆粒自然沉降，吸去或傾去不沉降的細小顆粒,，或者根據(jù)廠商的使用指南進行處理,，對預溶脹的凝膠，在布氏漏斗或玻璃燒結(jié)漏斗中用大量緩沖液冼去防腐劑,，重懸于等體積的凝膠過濾緩沖液,，傾入*過濾瓶中，在使用前進行脫氣,。
