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實(shí)驗(yàn)原理
    瓊脂糖凝膠電泳常用于分離,、鑒定 DNA、RNA 分子混合物,，以瓊脂凝膠作為支持物,，利用 DNA 分子在電場(chǎng)中時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的,。DNA 分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電,，在電場(chǎng)中由陰極向陽(yáng)極運(yùn)動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下,，忽略DNA分子攜帶的電荷,，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素,。DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子量成反比,。
    不同構(gòu)型的 DNA 分子的遷移速度不同。如環(huán)形 DNA 分子樣品,，其中有三種構(gòu)型的分子：超螺旋分子（cccDNA）,、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形 DNA 分子(IDNA),。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)?cccDNA＞IDNA＞ocDNA,。
    核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)。瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子,；聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和過(guò)硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長(zhǎng)鏈,，并通過(guò)交聯(lián)劑 N,N′-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成,。瓊脂糖凝膠適合分離200bp至近50kb的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝膠對(duì)于小片段（5bp-500bp）的分離效果很好,，且分辯力*,。選擇不同濃度的凝膠，可以分離丌同大小范圍的 DNA 分子,。電場(chǎng)強(qiáng)度愈大,，帶電顆粒的運(yùn)動(dòng)赹快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小,，所以電泳時(shí)一般采用低電壓,，不超過(guò) 6V/cm。而對(duì)于大片段電泳,，可以選擇 0.5-1.0V/cm 電泳過(guò)夜,。如果選擇高電壓電泳，可使用聚丙烯酰胺凝膠,。
    核酸電泳常采用 TAE,、TBE、TPE 三種緩沖系統(tǒng),。TAE 價(jià)格低廉,，但緩沖能力低。TPE 在進(jìn)行 DNA 回收時(shí),，會(huì)使 DNA 污染磷酸鹽,，影響后續(xù)反應(yīng)。所以綜合考慮,，多采用 TBE 緩沖液,。
    核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（EB）。溴化乙錠是一種扁平分子,，可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間,。在紫外線照射 BE-DNA 復(fù)合物時(shí)，通過(guò)發(fā)光指示核酸的位置,。由于EB有較強(qiáng)的揮發(fā)性和毒性,，現(xiàn)在大多選擇EB替代品進(jìn)行試驗(yàn)，比較常用的有g(shù)elred,，goldview,，ybr-green等，但是整體效果都若于傳統(tǒng)的EB,。
材料,、試劑及器具
1、材料
合適的Marker（分子量標(biāo)準(zhǔn)）,；DNA 樣品
2,、試劑
加樣緩沖液（6x或10x）；瓊脂糖,；溴化乙錠（EB）,。
3、器具
（1）電泳系統(tǒng)：電泳儀,、水平電泳槽,、制膠板等。
（2）凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀,。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
1,、按所分離的 DNA 分子的大小范圍，選擇合適的比例的凝膠,，稱取適量的瓊脂粉,，放到一錐形瓶中，加入適量的 TBE電泳緩沖液,。然后置微波爐加熱至瓊脂粉*溶化,，溶液透明。稍搖勻,，得膠液,。待膠液卻至 60℃左右，在膠液內(nèi)加入適量的比例的溴化乙錠液,。
2,、水平放置膠槽，在一端插好梳子,，在槽內(nèi)緩慢倒入已況至 60℃左右的膠液,，使之形成均勻水平的膠面。
3,、待膠凝固后,，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi),。
4,、在槽內(nèi)加入TBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過(guò)膠面,。
5,、把待檢樣品，按合適比例與加樣緩沖液混勻,，用移液槍加至凝膠的加樣孔中,。
6、接通電泳儀和電泳槽,，并接通電源,，調(diào)節(jié)合適電壓,，穩(wěn)壓輸出，開始電泳,。
7,、觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的位置。當(dāng)其移動(dòng)至約凝膠長(zhǎng)2/3處時(shí),，可停止電泳,。
8、在紫外透視儀的樣品臺(tái)上重新鋪上一張保鮮膜,，趕去氣泡平鋪,，然后把凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門,，打開紫外燈（360nm 或 254nm）,，通過(guò)觀察孔進(jìn)行觀察。
注意事項(xiàng)
1,、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性,、強(qiáng)致癌性物質(zhì)，務(wù)必小心,，勿沾染于衣物,、
皮膚、眼睛,、口鼻等,。所有操作均只能在專門電泳區(qū)域操作，戴一次性手套,，并及時(shí)更換,。
2、預(yù)先加入EB 時(shí)可能使 DNA 的運(yùn)動(dòng)速度下降15%左右,，且不同構(gòu)型的 DNA 的影響程度不同,。所以為取得較真實(shí)的電泳結(jié)果可以在電泳結(jié)束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解,，若凝膠放置一段時(shí)間后才觀察,，即使原來(lái)膠內(nèi)或樣品已加 EB，建議選擇EB溶液浸泡染色,。
3,、加樣進(jìn)膠時(shí)不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時(shí)**,，否則,，需重新制膠。
4、電泳時(shí)溴酚蘭在瓊脂糖凝膠中的運(yùn)動(dòng)速度可以用于參考電泳速度,，已實(shí)際電泳條帶運(yùn)動(dòng)速度為準(zhǔn),。
常見(jiàn)問(wèn)題分析