Nanofilm體積排阻（SEC）固定相是以高純度具有良好機(jī)械穩(wěn)定性的硅膠為基質(zhì),，表面化學(xué)鍵合有一層均一、親水,、納米厚度的中性聚合物薄膜,。 該固定相的一個特點是可使用低鹽濃度，或含有機(jī)溶劑的緩沖液作為流動相進(jìn)行生物樣品的分離,，并具有高的分辨率和樣品回收率,。該色譜填料為窄粒徑分布的球形 硅膠顆粒,。孔徑規(guī)格有150,、250,、450和950Å。

不同規(guī)格Nanfilm SEC固定相的特征參數(shù)

● 高的分辨率和分離效率
● 在高濃度鹽溶液中非常穩(wěn)定
● 高的重復(fù)性
● 可在低濃度鹽溶液中進(jìn)行蛋白的分離
● 高的蛋白回收率，并可保持其生物活性
● pH適用范圍2-9

高效分離

    對于生物分離而言,，生物分子與填料之間的非特異性相互作用往 往會導(dǎo)致低的分離效率,，如色譜峰拖尾以及低的回收率等。Nanofilm SEC填料所采用的*的表面化學(xué)技術(shù)可以在硅膠表面共價鍵合一層均勻的聚合物鏈,。這種固定相具有中性和親水的性質(zhì),，因此可以zui大限度消除填料基質(zhì)與生物 分子，其中尤其是與蛋白之間的非特異性相互作用,。這種經(jīng)過特別設(shè)計的涂層可以使Nanofilm SEC柱獲得高的分辨率和分離效率,。例如，以尿嘧啶作為測試物可以獲得高達(dá)每米90,000的理論塔板數(shù)（見表1）,。

表1 Nanofilm SEC柱的柱效,，以尿嘧啶為待測物（0.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.0）

標(biāo)準(zhǔn)蛋白分離

    賽分Nanofilm SEC柱高效分離的*個例子見圖1,。四種蛋白質(zhì),，甲狀腺球蛋白、BSA二聚體,、BSA和溶菌酶,，以及一種多肽在Nanofilm SEC柱上得到了滿意的分離。以溶菌酶計得到的理論塔板數(shù)高至30,000/m,，因此溶菌酶中的一種雜質(zhì)都可以得到很好的分離,，而這種分離效果通常只有在 高效毛細(xì)管電泳中才看得到。SEC柱的標(biāo)準(zhǔn)測試樣品通常為Biorad 標(biāo)準(zhǔn)蛋白（甲狀腺球蛋白,、免疫球蛋白G ,、卵清蛋白、肌球素）,。這些蛋白質(zhì)的pI均小于7.5,，因此在pH=7.0時不會帶有明顯的正電荷。但是高度帶正電荷的蛋白質(zhì),，如溶菌酶（pI 11.0）,、細(xì)胞色素（pI 10.6）,、抑肽酶（pI 11.0）卻容易與填料表面的殘余硅羥基發(fā)生強(qiáng)靜電相互作用而非常難被洗脫。Nanofilm SEC柱不存在這個問題,。而且,，賽分公司建立了自己的蛋白測試標(biāo)準(zhǔn)樣品，其中就包括了對生物分離性能非常敏感的溶菌酶,。

圖1 在4.6mm I.D.×250mm Nanofilm SEC-150柱上分離4種蛋白和一個多肽,。

BSA與BSA二聚體的分離

    從圖2可以看到，Nanofilm SEC-250柱（4.6mm I.D.×300mm）,，可以獲得牛血清白蛋白（BSA）和BSA雙聚體的分離,，其中流動相為150mM的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）。

甲狀腺球蛋白中聚合體的分離

    甲狀腺球蛋白是一個大分子量蛋白（MW 670,000）,。商品化的甲狀腺球蛋白含有聚合體雜質(zhì),，可能是雙聚體或四聚體。從圖3可以看到,，Nanofilm SEC-500可以對甲狀腺球蛋白和甲狀腺球蛋白聚合體實現(xiàn)基線分離,。

圖3 用Nanofilm SEC-500柱（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）從甲狀腺球蛋白中分離出聚合體。

孔結(jié)構(gòu)對分離的影響

    SEC填料孔徑的大小在蛋白分離中起到至關(guān)重要的作用。對于在某一特定分子量范圍內(nèi)分布的蛋白樣品而言,，Nanofilm SEC固定相規(guī)格的選擇需要基于填料的排除極限和線性分子量范圍這兩個參數(shù),。

    圖4為具有不同孔徑的Nanofilm SEC柱對分子量在120-670,000之間分布的三種蛋白的分離,，從中可以看到Nanofilm SEC填料孔徑的不同對分離的影響。

高的蛋白回收率及蛋白活性的保持

    Nanofilm SEC填料是在硅膠表面zui大限度地共價鍵合一層親水的中性薄膜,。蛋白或其它生物分子與這種填料的相互作用非常小,。因此，蛋白在硅膠表面的吸附將會被抑制,， 這就保證了高的回收率,，并可使蛋白在分離之后依然有著高的生物活性。表2是實驗測得的酸性蛋白BSA和堿性蛋白溶菌酶的回收率數(shù)據(jù),。

表2 蛋白在Nanofilm SEC柱上的回收率（色譜柱規(guī)格4.6mm I.D.×250mm,，流動相為0.15M磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）

Nanofilm SEC固定相的高穩(wěn)定性

    Nanofilm SEC固定相具有致密的涂層鍵合密度,，因此可阻止任意分子破壞硅膠與固定相之間的鍵合,，從而保證填料具有高的穩(wěn)定性。Nanofilm SEC固定相可用于多種緩沖液中,，如醋酸銨,、磷酸鹽、Tris等,。當(dāng)用150和100mM的磷酸緩沖液（pH7.0）作為流動相時,，在3個月或進(jìn)樣 1000次后Nanofilm SEC柱的性能僅會發(fā)生輕微的改變，保留時間的偏差在5%以內(nèi),。圖5是Nanofilm SEC-150在1,、5和10天，每天運行10小時得到的結(jié)果,。從圖中可以看到流出曲線基本重合,。圖6是兩周內(nèi)蛋白和一個小分子在500倍柱體積內(nèi)保留時 間的變化情況,。從圖中可以看到保留時間變化的差異非常小。 Nanofilm SEC固定相可在高鹽濃度,，如1.0M下使用,。另外，Nanofilm SEC柱在有機(jī)溶劑如甲醇,、乙醇,、THF、DMF,、DMSO等中,，以及其與水的混和溶液中也相當(dāng)穩(wěn)定。 Nanofilm SEC柱在pH 2-8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定,。另外,，在短時間內(nèi)也可以耐受高的pH，如pH 8.5-10,。 Nanofilm SEC柱在溫度耐受方面表現(xiàn)突出,。zui高工作溫度可達(dá)到80°C。

蛋白分子量的校正

     對于SEC而言，填料孔徑的大小決定了所能分離的分子量范圍,，而孔體積則決定了分離容量,。Nanofilm填料擁有4種孔徑規(guī)格，可以覆蓋一個寬范圍分子 量分布的生物大分子,。圖7是Nanofilm SEC-150,、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500的蛋白分子量校正曲線,。

圖7 Nanofilm SEC柱的蛋白分子量校正曲線圖。色譜條件：色譜柱4.6mm I.D.´300mm, 填料粒徑為5µm,；流動相為150mM磷酸鹽緩沖液, pH 7.0,；流速為0.25mL/min；檢測波長為214nm,；進(jìn)樣體積為5µL,。樣品為: 1. 甲狀腺球狀蛋白(670kD), 2. IgG(150kD), 3. BSA雙聚體(132kD), 4. BSA (66kD), 5. 卵清蛋白(44kD),  6. 肌紅蛋白(17.6kD), 7. 溶菌酶(14.3kD), 8. B12 (1.35kD), 9. 尿嘧啶(120D)。

     另一種廣泛使用的表征SEC固定相的方法是以蛋白的分子量對擴(kuò)散系數(shù)（K_d）作圖,。K_d按下式定義： K_d = (Ve-Vo)/(V_T-Vo) 其中Ve,、VT和Vo分別是樣品洗脫體積，色譜柱的總體積和柱的死體積,。蛋白分子量和Kd的線性區(qū)間經(jīng)常會被作為SEC固定相選擇的參考,。如圖8所示，Nanofilm SEC-150在一個寬的分子量范圍內(nèi)分子量和K_d之間有著良好的線性關(guān)系,。

圖8 Nanofilm SEC-150的蛋白分子量校正曲線,。色譜柱：Nanofilm SEC-150 (4.6mm I.D.×150mm, 5µm)；流動相：100mM磷酸緩沖液,，pH 7.0,；流速：0.25mL/min；檢測波長：UV 214nm,；溫度：室溫（23°C）；進(jìn)樣體積,，5µL,。樣品：（1） 甲狀腺球蛋白（670KD）；（2） IgG（150KD）,；（3）BSA雙聚體（132KD）,；（4 ）BSA（66KD）；（5）卵清蛋白（44KD）,；（6）a-胰凝乳蛋白酶（25KD）,；（7）肌紅蛋白（17.6kD）；（8）溶菌酶 （14.3kD）,；（9）多肽樣品（1.5kD）,；（10）尿嘧啶（120D）。

低鹽濃度下蛋白的分離

     對于帶正電荷蛋白的分離,，往往需要用高鹽濃度來減弱硅膠基質(zhì)與蛋白之間的強(qiáng)靜電相互作用,。比如細(xì)胞色素C是一種富含正電荷的蛋白質(zhì)（pI=9.6），因此 很難在低鹽濃度（比如50mM磷酸鹽緩沖液,， pH 7.0）下被洗脫出來,。使用高鹽濃度洗脫會限制SEC柱在蛋白分離中的應(yīng)用,。賽分公司所開發(fā)的Nanofilm SEC柱可以有效地分離帶正電荷的蛋白質(zhì)。如圖9所示,，采用Nanofilm SEC-500柱,，細(xì)胞色素C可以在50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中得到很好的分離，而這種分離效果是其它硅膠基質(zhì)SEC柱所無法實現(xiàn)的,。Nanofilm SEC柱的出現(xiàn)為SEC開拓了許多新的應(yīng)用領(lǐng)域,，例如分離對鹽敏感的生物分子，蛋白相互作用的研究,，以及LC/MS檢測等,。

圖9 細(xì)胞色素C在不同磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中的流出曲線。 色譜柱：Nanofilm SEC-250柱(5µm, 4.6mm I.D.×300mm),； 流速：0.35mL/min,； 檢測波長：UV 214nm； 溫度：室溫（23°C）,； 進(jìn)樣體積,，5µL； 樣品濃度,，1.0mg/mL,。

SRT SEC和Nanofilm SEC的比較

     與Nanofilm SEC相比，SRT SEC具有更高的分離容量和分辨率,，可供選擇的孔徑規(guī)格也要比前者多,。但是，Nanofilm SEC在一些應(yīng)用,，如使用低鹽濃度或含可揮發(fā)性鹽的有機(jī)溶劑作為流動相進(jìn)行富含正電荷生物分子的分離,，多維色譜分離，以及LC/MS等中表現(xiàn)得更為穩(wěn)定,， 而這是傳統(tǒng)SEC固定相所無法實現(xiàn)的,。另外，SRT和Nanofilm SEC固定相也具有不同的選擇性,。SRT和Nanofilm SEC固定相可以組合起來使用,，從而可為生物分子，水溶性聚合物,，病毒和細(xì)菌,，以及納米顆粒等的分離提供一個完整的分離方案。