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1960年代，由于氣相色譜對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的局限性,，為了分離蛋白質(zhì),、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜,。1960年代末科克蘭（Kirkland）,、哈伯、荷瓦斯(Horvath),、莆黑斯,、里普斯克等人開發(fā)了世界上*臺(tái)液相色譜儀，開啟了液相色譜的時(shí)代,。液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱,，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相,，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)完成,。
工科學(xué)生zui常使用的液相色譜的參考書籍1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書，標(biāo)志著液相色譜法 (HPLC)正式建立,。在此后的時(shí)間里,，液相色譜成為zui為常用的分離和檢測手段，在有機(jī)化學(xué),、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué),、藥物開發(fā)與檢測,、化工、食品科學(xué),、環(huán)境監(jiān)測,、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。液相色譜同時(shí)還極大的刺激了固定相材料,、檢測技術(shù),、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。
1960年代前,，使用的填充粒大于100μm,，提高柱效面臨著困境，后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸,?？瓶颂m、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相,，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼,，實(shí)現(xiàn)了高速傳質(zhì),，為液相色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了穩(wěn)固的基礎(chǔ)。隨著填料粒徑的降低,，更高的柱效也得以實(shí)現(xiàn),。1960年代研制出氣動(dòng)放大泵、注射泵及低流量往復(fù)式柱塞泵,，但后者的脈沖信號(hào)很大,，難以滿足液相色譜的要求。1970年代,，往復(fù)式雙柱塞恒流泵,，解決了這一問題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠,，平均粒徑只有7μm,，具有*的柱效，并逐漸取代了無定形微粒硅膠,。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩(wěn)定性大為提高,，多次使用成為可能。1970年后,，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點(diǎn),。1980年后，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題,，人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到改變流動(dòng)相的組成事提高選擇性的關(guān)鍵,。